يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم الارتباطات بالهيكل النووي بدلا من استخدام تسلسل DamID ، وهو فحص خلية واحدة. الميزة الرئيسية لاستخدام هذه الطريقة هي أنها فعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها بسهولة. يمكن أن يسلط الضوء على الاختلافات الوظيفية بين الجينات والكروموسومات التي قد لا تحدث عادة مع تقنيات التصور الأخرى.
يمكن تقييم المنظمات المكانية والوظيفية داخل الجينوم في خلايا السرطان والبروجيريا المعالجة والاختلافات السلوكية الجينومية في الخلايا الهرمة باستخدام هذا البروتوكول. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع من الخلايا أو الأنسجة عبر العمر وأي مرض. يمكن استخدامه أيضا في الكائنات الحية النموذجية حيث تتوفر المجسات.
للبدء ، تحضير 500 ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك 10 ٪ وصبها في دورق كبير. إسقاط الشرائح المجهر بشكل فردي في الحمض واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر تعيين إلى اثنين G.صب الحمض من دورق وغسل الشرائح 10 مرات في ماء الصنبور. ثم 10 مرات أخرى في الماء منزوع الأيونات.
شطف الشرائح في الميثانول مرتين والاحتفاظ بها في الميثانول حتى التعقيم. ضع الشرائح على منشفة ورقية لتجف ولفها بورق القصدير للتعقيم في الأوتوكلاف أو الفرن الساخن. تنمو الخلايا في الوسط المناسب مع المصل لمدة 48 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم الوصول إلى التقاء 60 إلى 70٪.
احصد كل نوع من الخلايا وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بذرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخمس في 10 ملليلتر من الوسط لكل شريحة. قم بإزالة طبق الثقافة الذي يحتوي على الشرائح والخلايا المرفقة من الحاضنة.
تجاهل الوسيط وقم بتسمية الشرائح باستخدام قلم رصاص. ثم ضعها في وعاء كوبلين يحتوي على 50 مل من المخزن المؤقت للهيكل الخلوي البارد الجليدي. احتضان الجرة لمدة 15 دقيقة على الجليد أو عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المخزن المؤقت للهيكل الخلوي واشطف الشرائح بسرعة في 50 ملليلترا من محلول هالة الحمض النووي لمرة واحدة ثلاث مرات عن طريق غمسها في جرة كوبلين مع المخزن المؤقت. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين تحتوي على 50 مل من العازلة استخراج واحتضان لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الشرائح على التوالي في 50 ملليلتر من 10 مرات ، خمس مرات ، مرتين ، ومرة واحدة هالة الحمض النووي العازلة لمدة دقيقة واحدة لكل منهما.
عند الانتهاء ، اغمس الشرائح من خلال سلسلة إيثانول متسلسلة من الإيثانول 10 و 30 و 70 و 95٪. خذ الشرائح من خلال سلسلة متسلسلة من الإيثانول 50 ملليلتر من الإيثانول 70 و 90 و 100٪ لمدة خمس دقائق لكل منها. جففها بالهواء على طبق دافئ.
ثم تخبز في فرن 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتشويه الشرائح عن طريق وضعها في 70٪ فورماميد مرتين محلول SSC لمدة دقيقتين عند 70 درجة مئوية. ضع الشرائح المشوهة في 50 ملليلتر من الثلج البارد 70٪ إيثانول لمدة خمس دقائق.
ثم حركها عبر سلسلة إيثانول من 90 و 95 و 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل منها. عند الانتهاء ، جفف الشرائح في الهواء على لوحة الاحتماء. قم بتشويه مجسات الحمض النووي عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة ساخنة أو حمام مائي.
ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل سحب 10 ميكرولتر على الشريحة المناسبة. قم بتراكب المسبار بغطاء 21 × 21 ملم وختمه بالأسمنت المطاطي. احتضان الشرائح لمدة لا تقل عن 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة تهجين مرطبة.
بعد الحضانة ، قم بإزالة الأسمنت المطاطي بعناية بالملقط. ثم احتضان الشرائح في 50 ملليلتر من محلول فورماميد 50٪ مرتين SSC عند الرقم الهيدروجيني السابع الذي تم تسخينه مسبقا إلى 45 درجة مئوية لمدة ثلاث حضانات لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع الشرائح في 50 ملليلترا من محلول SSC 0.1 مرة الذي تم تسخينه مسبقا إلى 60 درجة مئوية ، ولكن تم وضعه في حمام مائي 45 درجة مئوية.
احتضان لمدة خمس دقائق واستبدال المخزن المؤقت مرتين لحضانة لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على 50 مل من محلول SSC أربع مرات في درجة حرارة الغرفة واحتضانها لمدة 15 دقيقة مع ثلاثة تغييرات من المخزن المؤقت. لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة ، ضع 100 ميكرولتر من محلول SSC 4٪ BSA أربع مرات على كل شريحة وقم بتغطيتها بقطعة من فيلم البارافين.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم احتضان الشرائح مع 100 ميكرولتر من streptavidin Cy3 المخفف واحد في 200 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للكشف عن التحقيق المسمى. ضع الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على 50 مل من محلول SSC أربع مرات في درجة حرارة الغرفة واحتضانها لمدة 15 دقيقة مع ثلاثة تغييرات من المخزن المؤقت.
قم بتركيب الشرائح في 20 ميكرولترا من محلول تركيب يحتوي على DAPI وتراكب مع غطاء 22 × 50 ملم. تصور هالات الحمض النووي ومناطق الكروموسوم باستخدام مجهر التألق مع هدف زيت 100X. يتيح تحضير هالة الحمض النووي رؤية حافة النواة المتبقية ، والحمض النووي المتبقي داخل النواة المتبقية ، والحمض النووي غير المرتبط الذي تم تخزينه في المنطقة المحيطة.
تم إنشاء هالات الحمض النووي للخلايا الليفية الجلدية البشرية المتكاثرة من الخلايا ذات BRDU المدمجة ثم تلطخت لاحقا بالأجسام المضادة المضادة ل BRDU. كانت الخلايا المتكاثرة إيجابية ل BRDU ومضاد pKi-67. تم استخدام هذا البروتوكول لتصور مناطق الكروموسوم داخل هالات الحمض النووي.
تم تمييز الكروموسومات الفردية بمجسات طلاء كروموسوم الذراع الكاملة المحددة للكروموسومات 1 و 13 و 17 و 18. تم استخدام Anti-pKi-67 لتحديد الخلايا المتكاثرة وغيابها داخل نفس الثقافة. يتم عرض مستحضرات هالة الحمض النووي مع التيلوميرات باللون الأخضر هنا.
من الممكن ملاحظة نسبة التيلوميرات في هالة الحمض النووي ، خاصة في صورة التجربة الثانية. كان متوسط النسبة المئوية للتيلوميرات حوالي 17٪ في الخلايا الهادئة. تم الكشف عن اختلافات في ارتباط الكروموسوم في الخلايا الليفية الضابطة الأولية وفي الخلايا المريضة المصابة بمتلازمة هتشينسون جيلفورد بروجيريا النموذجية وغير النمطية ، معبرة عن شكل متماثل مختلف من Sun1 ولا توجد طفرة Lamin A.
يظهر الكروموسومان واحد و 13 اختلافات ذات دلالة إحصائية في ارتباطهما داخل النوى المتبقية عند مقارنتهما بهالات الحمض النووي الخاضعة للرقابة. ارتبط موضع منطقة الكروموسوم بأكملها بالنواة المتبقية وهالة الحمض النووي. عند محاولة هذا البروتوكول ، تأكد من زرع الخلايا بالكثافة الصحيحة واستخراجها في الوقت المناسب.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء التألق المناعي غير المباشر و RNA FISH.
