Este protocolo pode ser usado para avaliar ligações ao nucleoesqueleto em vez de usar o sequenciamento DamID, e é um ensaio de célula única. A principal vantagem de usar esse método é que ele é econômico e de fácil acesso. Isso pode destacar diferenças funcionais entre genes e cromossomos que normalmente não ocorrem com outras técnicas de visualização.
Organizações espaciais e funcionais dentro do genoma em células de câncer e progéria tratadas e diferenças comportamentais genômicas em células senescentes podem ser avaliadas usando este protocolo. Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou tecido ao longo da vida e de qualquer doença. Também pode ser usado em organismos modelo onde as sondas estão disponíveis.
Para começar, prepare 500 mililitros de ácido clorídrico a 10% e despeje em um copo grande. Soltar lâminas do microscópio individualmente no ácido e incubá-las por uma hora à temperatura ambiente em um agitador ajustado para dois G.Decant o ácido do copo e lavar as lâminas 10 vezes em água da torneira. Em seguida, mais 10 vezes em água deionizada.
Enxágue as lâminas em metanol duas vezes e mantenha-as em metanol até a esterilização. Incline as lâminas sobre um papel toalha para secar e envolva-as em papel alumínio para esterilização em autoclave ou forno quente. Cultivar células no meio apropriado com soro por pelo menos 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até atingir 60 a 70% de confluência.
Colher cada tipo celular e contar as células usando um hemocitômetro. Semeando uma vez de 10 a cinco células em 10 mililitros de meio por lâmina. Remova a placa de cultura que contém as lâminas e as células anexadas da incubadora.
Descarte o meio e rotule as lâminas usando um lápis. Em seguida, coloque-os em um frasco de coplin contendo 50 mililitros de tampão de citoesqueleto gelado. Incube o frasco por 15 minutos no gelo ou a quatro graus Celsius.
Descarte o tampão do citoesqueleto e lave rapidamente as lâminas em 50 mililitros de tampão de halo de DNA único três vezes, mergulhando-as em um frasco de coplina com o tampão. Transfira as lâminas para um frasco de coplin contendo 50 mililitros de tampão de extração e incube por quatro minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incube consecutivamente as lâminas em 50 mililitros de 10 vezes, cinco vezes, duas vezes e uma vez tampão halo de DNA por um minuto cada.
Quando terminar, mergulhe as lâminas através de uma série sequencial de etanol de 10, 30, 70 e 95% de etanol. Leve as lâminas através de uma série sequencial de 50 mililitros de etanol de 70, 90 e 100% de etanol por cinco minutos cada. Seque-os ao ar em uma placa de aquecimento.
Em seguida, leve ao forno a 70 graus Celsius por cinco minutos. Desnaturar as lâminas colocando-as em solução de 70% de formamida duas vezes SSC por dois minutos a 70 graus Celsius. Coloque as lâminas desnaturadas em 50 mililitros de etanol gelado a 70% por cinco minutos.
Em seguida, mova-os através de uma série de etanol de 90, 95 e 100% à temperatura ambiente por cinco minutos cada. Quando terminar, seque ao ar as lâminas em uma placa de aquecimento. Desnature as sondas de DNA a 75 graus Celsius por 10 minutos em um bloco quente ou banho de água.
Em seguida, incube-os a 37 graus Celsius por 30 minutos antes de pipetar 10 microlitros na lâmina apropriada. Sobreponha a sonda com uma lamínula de 21 por 21 milímetros e sela-a com cimento de borracha. Incubar as lâminas por um período mínimo de 18 horas a 37 graus Celsius em uma câmara de hibridização umedecida.
Após a incubação, remova cuidadosamente o cimento de borracha com pinças. Em seguida, incubar as lâminas em 50 mililitros de formamida a 50% duas vezes solução de SSC em pH sete que foi pré-aquecida a 45 graus Celsius por três incubações de cinco minutos. Em seguida, coloque as lâminas em 50 mililitros de solução de SSC 0,1 vezes que foi pré-aquecida a 60 graus Celsius, mas colocada em banho-maria de 45 graus Celsius.
Incubar por cinco minutos e substituir o tampão duas vezes por incubações de cinco minutos. Colocar as lâminas em um frasco de coplin contendo 50 mililitros de solução de SSC quatro vezes à temperatura ambiente e incubar por 15 minutos com três trocas de tampão. Para evitar a ligação de anticorpos inespecíficos, aplique 100 microlitros de solução de BSA 4% quatro vezes SSC em cada lâmina e sobreponha-a com um pedaço de filme de parafina.
Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, incubar as lâminas com 100 microlitros de estreptavidina, Cy3, diluídas uma em 200 por uma hora à temperatura ambiente para detectar a sonda marcada. Colocar as lâminas em um frasco de coplin contendo 50 mililitros de solução de SSC quatro vezes à temperatura ambiente e incubar por 15 minutos com três trocas de tampão.
Monte as lâminas em 20 microlitros de uma solução de montagem contendo DAPI e sobreponha com uma lamínula de 22 por 50 milímetros. Visualize halos de DNA e territórios cromossômicos usando um microscópio de epifluorescência com uma objetiva de óleo de 100X. A preparação do halo de DNA torna possível ver a borda de um núcleo residual, o DNA remanescente dentro do núcleo residual e o DNA não anexado que se espalhou para a área circundante.
Halos de DNA de fibroblastos dérmicos humanos em proliferação foram criados a partir de células com BRDU incorporado e posteriormente corados com anticorpo anti-BRDU. As células em proliferação foram positivas para BRDU e anti-pKi-67. Este protocolo foi usado para visualizar territórios cromossômicos dentro de halos de DNA.
Cromossomos individuais foram marcados com sondas específicas de pintura cromossômica de braço inteiro para os cromossomos 1, 13, 17 e 18. Anti-pKi-67 foi usado para marcar células em proliferação e sua ausência dentro da mesma cultura. Preparações de halo de DNA com telômeros em verde são mostradas aqui.
É possível observar a proporção de telômeros no halo de DNA, particularmente na imagem do experimento dois. A porcentagem média de telômeros foi de aproximadamente 17% nas células quiescentes. Diferenças na ligação cromossômica foram detectadas em fibroblastos de controle primário e em células doentes com síndrome de Hutchinson-Gilford progeria típica e atípica, expressando uma isoforma Sun1 diferente e nenhuma mutação Lamin A.
Os cromossomos um e 13 apresentam diferenças estatisticamente significantes em sua fixação dentro dos núcleos residuais quando comparados aos halos controlados de DNA. A posição de todo o território cromossômico foi correlacionada com o núcleo residual e o halo de DNA. Ao tentar esse protocolo, certifique-se de que as células sejam semeadas na densidade correta e extraídas no momento certo.
Após esse procedimento, pode-se realizar imunofluorescência indireta e RNA FISH.
