通过使用来自辐照的Buffy外套的饲养细胞的T淋巴细胞的分离和培养来研究主动脉瓣钙化

该协议易于执行。克隆阶段允许从新鲜样品中获得大量T克隆。此外，T细胞的表型和功能可以很容易地分析。

演示该程序的将是玛丽·克里斯托弗（Mary Christopher），她是我实验室的博士生。要诱导T细胞克隆，请使用带有无针阀的袋尖刺打开层流罩中的辐照淡黄色外套袋。将多达50毫升的血液从袋子转移到T-150烧瓶中，并在烧瓶中加入70毫升PBS。

小心地将30毫升稀释的血液分层到四个50毫升锥形管中每个20毫升的密度梯度上，并通过密度梯度离心分离细胞。小心地吸出上清液，并将PBMC从每个管转移到单个新的50毫升管中。使用PBS将最终体积提高到50毫升，并通过离心收集PBMC。

在相同条件下进行第二次洗涤后，将分离的饲养细胞悬浮在10毫升细胞培养基中进行计数，并将25毫升70毫升细胞培养基加入两个50毫升管中。然后将饲养层细胞以2×10的2×10加入每毫升补充IL-2浓度的细胞培养基的第6个细胞中。为了建立T淋巴细胞培养物，将含有来自狭窄瓣膜样品瓶的上清液的T细胞克隆池入单个50毫升管中，并通过离心收集细胞。

每次洗涤在50毫升PBS中洗涤沉淀三次，然后将细胞重新悬浮在1毫升细胞培养基中进行计数。将细胞稀释至每毫升浓度为1×10至第3个细胞，并将500微升细胞加入补充有IL-2的细胞培养基管中，不含饲养层细胞。将饲养池悬浮液加入塑料100×15毫升培养皿中，并向适当数量的U型底96孔板的每个孔中加入100微升的饲养池进行实验。

然后将T细胞加入培养皿中，并向补充良好的每个饲养细胞中加入100微升T细胞，在细胞培养箱中孵育一周。PBMC分离对于获取饲养层细胞以及检测和表征主动脉瓣样品中浸润的白细胞至关重要。孵育两周后，可以获得克隆T细胞群。

这里显示了用于分析钙化主动脉瓣疾病患者T细胞亚群的门控方案。正如在该患者中观察到的那样，CD4 + T细胞比CD8 + T细胞更多。未克隆 T 细胞的流式细胞术分析证实，天然瓣膜和克隆样品中都存在相同的 T 细胞标志物。

综上所述，这些数据表明T细胞存在于具有CD45 +白细胞的钙化主动脉瓣中，这表明钙化主动脉瓣疾病与免疫系统的激活和炎症活性有关。这种方法非常通用。它可以应用于不同的方案，研究人员需要能够从组织中分离细胞，以进行功能表征。

请记住，在无菌条件下工作以避免污染，并在显微镜下批判性地观察细胞非常重要。