嗨，我叫古普雷特。我们的实验室调查肺部炎症和修复机制。嗨，我的名字是杰西卡，我使用荧光显微方法研究臭氧引起的实验鼠藻类。
大家好，我叫曼普雷特。我用动物成像方法研究肺部炎症。肺部不断面临由无菌（如臭氧）和微生物成分（如细菌脂糖或LPS）引起的直接和间接的侮辱。
由于不受管制的宿主免疫、凝固和组织重塑，压倒性的宿主反应可能导致呼吸受损和急性肺损伤，其特征是肺中性粒细胞的招募。我们描述了对各种隔间的全面分析，即支气管-肺气管熔岩液，即BAL，肺血管灌注，即LVP，左肺低温部分，外周血液和胸骨和股骨骨髓。对于臭氧暴露，轻轻地将小鼠放在自定义感应箱中，并连续将小鼠暴露在 0.05 PPM 的臭氧中两小时。
对于LPS暴露，麻醉下轻的内皮氯胺酮和锡拉津混合的小鼠。现在将LPS溶液中的50微升灌输到小鼠外部鼻孔中。用50微升无菌盐水灌输控制小鼠。
在指定时间点，用全剂量的氯胺酮和西拉津混合物麻醉小鼠。接下来对小鼠进行消毒，检查脚踏车反射，即捏紧后肢数字中的两个，并观察肢体的缩放。没有反射意味着深度麻醉。
现在在胸骨下面切一下，露出心脏。将附着在肝化注射器上的25号针头放入右心室，通过心脏穿刺抽血。将血液收集到肝素化注射器中，然后排入微富管中进行进一步处理。
小心使用钳子或钝钳子清除气管区域从过度组织。现在切开肋骨笼露出肺。通过气管下方的棉连字，暂时离开它。
狙击气管，间隔在大约三分之一的长度从肺气管切除术。将 28 号仪表聚乙烯管插入气管中。牢固地系上棉连结，将管子保持到位。
确保你不会把管骨塌陷。现在在一个mL注射器的帮助下，逐渐将0.5毫升的PBS注射到罐中。注射 PBS 后，只要注射器不抵抗吸力，就将其吸气。
将吸气液收集到标记的微噬菌管中，并重复此过程两次。在胸腔和腹部两半之间切下胸动脉，以避免在肺灌注期间有任何备份。在切口主动脉末端附近无血的空腔中划破。
接下来用0.5毫升的室温肝盐水给肺部灌注，通过右心室注射。从下行胸动脉切端的腔中收集血管灌注。将右支气管套合后，让左肺充气0.5毫升甲醛5分钟。
现在消毒腹部部分。切腹部部分，并从骨盆骨中切入。收集骨盆骨，将左右股骨隔离在冰上盐水填充的培养皿中。
将腹肋笼和胸骨收集到充满盐水的培养皿中，该菜也保存在冰上。用 0.5 毫升盐水将骨骼的切口端用 4 次灌注到 1 个 ML 注射器上。将每根骨头的分数收集到贴有标签的猎鹰管中，装有过滤器并放置在冰上。
在 3000 RPM 下将所有样品离心 10 分钟。收集超子并闪存冻结它们。在至少200微升PBS中重组细胞。
执行总白细胞计数。用钙蛋白绿色和红色同质体混合的另一种BAL液体染色一个污渍。分析超自然的化疗因子和总蛋白质浓度。
将细胞离心，在每个幻灯片上准备两个细胞针，并染色生化和免疫蛋白。对所有组的肺冷冻进行改性 H 和 E 染色。手动勾勒出合并后的图像面板中的 150 到 200 个单元格。
将感兴趣的概述区域复制到所有渠道。测量所有通道的预设参数。将染色分子的荧光强度除以DAPI或CD61。
这些称为DAPI或CD 61规范化荧光强度比。接下来绘制参数以评估暴露后的任何更改。虽然，合并接触不会诱发BAL、LVP或骨骼骨髓细胞计数的任何变化，但小鼠在24小时内表现出全身白细胞增多症，随后在接触后72小时出现白血病。
这些显示在外周血细胞计数中。股骨骨髓细胞计数显示，与所有时间点相比，晚高峰为72小时。请注意，在 BAL 细胞平图像中，多态核细胞中 24 小时内没有西格莱克-F 和 CX3CRI 染色。
BAL 和 LVP 细胞针显示在零时存在大型 CD11b 和 GR1 正单核细胞。多晶体核细胞在暴露后作为主要细胞类型出现在所有隔间中。BAL 总蛋白质含量在合并暴露后 36 小时内最高。
然而，LVP蛋白在接触后保持不变。在 LVP 的四个小时中，eotaxin-2 和交皮金 -2 的水平最高。这些化疗因BAL部分而减少。
有趣的是，中性粒细胞报警IL-16和许多与生俱来的化疗因子在LVP中被改变，但不是BAL部分。在基线上，超过95%的BAL细胞是单核的，显示出皮质作用素、拉米利波迪亚、应力和图布林纤维，它们对减少线粒体染色具有很强的积极作用。在四个小时，我们观察到圆形BAL细胞，它失去了作用，但显示了一个分散的微管网络，如红色和较低的减少线粒体染色。
在联合暴露的早期，BAL细胞对钙素和同二体-1的检测呈双阳性，这表明部分受损的细胞。在36小时，BAL细胞基本上是可行的，即绿色。我们观察到分离的ATPα和Ly6G染色在BAL大噬细胞和嗜中性粒细胞。
我们观察到DAPI规范化ATPα的减少和细胞内Ly6G蛋白质含量的增加。联合暴露诱导巴、天然杀伤细胞和K1.1、中性粒细胞ATP、亚单位PETA、增殖因子、Ki-67和中性粒细胞GR1、血小板CX3CRI和BAL细胞中抗血管生成血管他汀蛋白的持续表达。虽然支气管和血管隔膜损伤是预料之中的，但令人惊讶的是，在暴露后36小时内观察到大型容器中的细胞聚集物。
最后，我们在这张表中总结了结果。我们希望我们的murine模型是一个容易获得的原型，可以在二级遏制实验室复制，用于研究侵入性细胞死亡和感染的机制。谢谢。
