小鼠窦房和房室结常驻心脏巨噬细胞的分离和培养

我们描述了一种通过荧光激活细胞分选特异性从小鼠的鼻窦和AV结中分离心脏驻留微噬细胞的显微解剖和随后分离的方案。通过对鼻窦和V结进行精确的显微切割，然后结合磁性和荧光激活细胞分选，我们能够特异性地从窦和V淋巴结中分离出高纯度的常驻巨噬细胞。从心脏不同区域鉴定和分离心脏驻留巨噬细胞可以进一步研究它们的表型及其对心脏电生理学的区域特异性影响。

分离心脏后，在解剖显微镜下用冰冷的一次性PBS在解剖皿中进行显微解剖程序。使用心脏解剖标志物（如主动脉、肺动脉、冠状窦和左心室或右心室）来确定心脏的左右和前后。确定方向后，将心脏与前部放在培养皿底部，以露出后大静脉。

沿着心室和心房之间的凹槽切割以去除大部分心室。保留心房部分。通过将销钉插入左心室自由壁和LAA的其余部分，将心脏固定在解剖盘上。

通过三尖瓣和上腔静脉向上切开剩余的无右心室壁。将 RA 和 RV 翻转开并固定 RAA 以暴露 RA 腔腔间区域和房间隔。对于 SAN 的显微解剖，沿着平行于终嵴的房间隔切开心脏以分离腔间区域以获得 SAN 样本。

将样品放入冰上的空1.5毫升微量离心管中。对于 AVN 的显微解剖，将心脏的其余部分穿过房间隔和室间隔相邻的组织，朝上房间隔的右侧。查看心内膜表面的右心房，寻找科赫三角形，该三角形将向前与三尖瓣隔叶的铰链线接壤，后部与托达罗的肌腱接壤。

在底部观察到冠状窦的孔口。用手术刀切碎 SAN 和 AVN 组织。然后向每个样品中加入500微升新鲜制备的消化缓冲液，并从微量离心管壁上洗涤所有切碎的组织。

轻轻移液以帮助消化样品并在涡旋机上均质组织。消化后，通过将组织悬浮液通过40微米细胞过滤器，将其转移到新鲜的15毫升离心管中。用额外的五毫升细胞分选缓冲液冲洗细胞过滤器以停止消化。

除去上清液。用90微升细胞分选缓冲液重悬细胞沉淀后，在15毫升离心管中的细胞悬液中每1000万个细胞中加入10微升CD45微珠。将样品充分混合。

在用微珠和抗体混合物孵育细胞悬液期间，通过将磁柱连接到合适的磁选器上，然后将收集管置于磁柱下方来制备磁分离装置。通过在色谱柱顶部添加500微升细胞分选缓冲液冲洗并让缓冲液通过来制备磁性色谱柱。在细胞分选缓冲液通过时，立即将细胞悬液涂在色谱柱上，避免气泡。

用500微升细胞分选缓冲液洗涤色谱柱三次。在色谱柱上加入一毫升细胞分选缓冲液。从磁选机中取出色谱柱并将其放在新的收集管上。

通过牢固地应用柱塞立即冲洗色谱柱，以获得含有磁性标记细胞的流通液。应用未染色的样品和补偿管后，调整每个通道的电压，使正负峰对齐到轴的适当位置。使用 DAPI 作为可行性标记，按照文本手稿中所述设置门控策略。

检查流式细胞术图表，确认感兴趣的细胞群正确显示在图表上。根据后续实验的需要将分选的细胞收集到培养基或缓冲液中。为了确认正确的解剖，使用免疫荧光和Masson的三色染色对SAN和AVN进行了鉴定。

此处显示了SAN和AVN中HCN4阳性传导系统细胞的免疫荧光染色，以及SAN和AVN的Masson三色染色。用于常驻心脏巨噬细胞细胞分选的门控策略有助于通过排除y轴与x轴前向散射区域中的双峰来识别单核细胞。DAPI排除了死细胞。

对CD45阳性白细胞进行活细胞门控，然后对CD11b阳性髓细胞进行门控。通过F4/80和CD64的表达来鉴定心脏巨噬细胞，然后通过淋巴细胞抗原六表达进行分层。在明场显微镜下观察新鲜分选的细胞。

在荧光团PE通道下观察时，细胞CD45呈阳性。当在荧光团APC大小为七通道下观察时，分选细胞的相同视图显示CD11b阳性细胞。使用荧光团PE尺寸七通道鉴定F4/80阳性表型。

三重阳性细胞被鉴定为心脏驻留巨噬细胞。在培养基中培养长达六天的分离心脏巨噬细胞用白色箭头表示，而黑色箭头表示死细胞。分选的巨噬细胞可用于进一步的功能研究，如膜片钳实验或表达研究，如RNA测序或蛋白质组学研究。