研究流动下血管药物靶向的体外3D细胞培养动脉模型

本议定书可作为研究和开发药物携带者针对人类血管系统内疾病部位的新平台。我们技术的主要优点是它允许研究药物携带者在人类复制的3D动脉模型内的积累。这是在生理条件下完成的，包括血流。

这种方法可用于优化药物携带者，用于诊断和治疗各种血管疾病，包括动脉粥样硬化动脉。首先从患者中选择图像或以前研究过的人类胡萝卜动脉分叉的几何形状，并利用图像创建模具的计算机辅助设计模型。使用 3D 打印机打印设计，拆下临时打印支架，用丙酮冲洗模型，然后使用砂纸对模具进行抛光和平滑，尤其是切割支架的区域。

打磨后，用异丙醇冲洗模型，去除任何塑料灰尘，并允许模型在化学罩中干燥两到三个小时。为了便于塑料幻灭，将模型喷洒三次透明漆，使漆在应用之间空气干燥一小时。最后一次应用后，使用油漆刷和漆胶将透明、矩形的光滑塑料条粘附到框架的每一侧，使模型密封在底部并在顶部打开。

干燥后，将模具放入干燥器中，慢慢将准备不良的硅橡胶溶液放入开口。去除气泡，直到混合物变清，并将霉菌留在干燥器内过夜。当混合物完全干燥时，取出透明滑梯，将模型浸入绝对丙酮中48小时，直到塑料完全溶解。

要在细胞播种前蒸发捕获的丙酮，在60摄氏度下孵育模型至少四天。要用细胞播种模型，首先通过紫外线或辐射对模型和两个入口和出口连接器进行消毒。20分钟后，使用注射器在37摄氏度下用每毫升100微克的4毫升涂层模型，为期两小时。

在孵化结束时，通过出口取出纤维素溶液，然后用内皮细胞介质清洗模型。使用注射器将冲洗模型填充 4 毫升，每毫升内皮细胞介质单元悬架为 4 毫升 2.5 倍 10 至第六内皮细胞，并按每分钟一次旋转将模型固定到细胞培养孵化器内的旋转器上 48 小时，以确保细胞的均匀分布。在孵化结束时，使用 10 毫升塑料注射器用 PBS 清洗模型。

用4毫升4%的甲醛修复细胞15分钟，然后用PBS清洗模型三次，如前所示，然后将模型储存在4摄氏度的新鲜PBS中。在开始实验之前，使用出口管将连接到渗透泵的振荡阻尼器连接到培养胡萝卜素模型的入口，并使用一根管子将两个插座合并。然后将出口管拆分成两个插座管，并在每个插管中加入一个塑料夹。

要设置闭路配置，在闭路容器中加入 300 毫升 PBS，将一个入口和一个插座管放在 PBS 填充容器内，打开 B 和 C 夹，然后将另一个进气管放入装满蒸馏水的一升洗涤容器中，将另一个出口管放入一个空的一升废容器中，关闭 A 和 D 夹， 分别。将胡萝卜素模型置于立体显微镜下，将泵设置为每分钟 10 转的启动流量速率，每分钟增量增加 5 次，每 4 到 5 分钟增加一次。当流量达到每分钟 100 转时，在闭路容器中每毫升 PBS 添加 1.6 微克荧光碳化聚苯乙烯颗粒，并在一个半小时内每 10 秒对感兴趣的区域进行成像。

要设置打开的电路配置，打开 A 和 D 夹，并立即关闭 B 和 C 夹。让大部分水以每分钟 100 转的速度从洗涤容器流到废容器。在水完全转移之前，停止泵，并在进水口前和胡萝卜素模型出口后关闭管夹。

使用适当的滤镜，在感兴趣的区域捕获模型的图像，以显示粒子沉积和粘附到细胞。实验完成后，使用定制的软件代码分析感兴趣的区域捕获的图像，输入图像名称并设置估计阈值。然后运行代码。

检查生成的图像和图像中粒子的计数数。在此具有代表性的分析中，可以通过亮场和荧光共聚焦显微成像来观察生长在 3D 胡萝卜动脉模型中的培养内皮细胞的照片显微图。荧光10微米直径的玻璃珠，播种到3D模型表现出一个再循环模式，建议在模型内成功地模仿生理条件。

粒子沉积的成像显示，在壁切变应力高的再循环区外观察到粒子与细胞的粘附程度较高。根据本协议，可以探索具有特定结合动力学的功能化粒子和不同人类动脉模型中细胞的核心培养，以改进模型并研究特定配方。该技术为研究药物携带者的血管靶向提供了一个新的平台。

我们最近用它来展示如何针对不同的患病血管区域定制粒子的添加性。