μTongue:一个基于微流体的功能成像平台，用于在Viva的舌头

此协议允许观察自然微环境下味觉细胞的功能，神经连接和血液循环保持不变。利用这种技术，细胞对细胞的通信可以在体内进行调查。首先，用人工唾液和口香剂填充加压流灌注系统的储层。

将压缩的气管连接到调节器输入，并将流体输送系统中的气压设置为每平方英寸 30 到 50 磅。将调节器的输出压力设置为每平方英寸 0.4 磅，并检查液体是否开始从管子中流出。将从储层到微舌输入端口的歧管连接起来，然后将微舌的输出端口连接到注射器泵，并以每分钟约 300 微升的速度提取液体，以建立稳定的状态状态。

确认悬挂在微舌下的水滴体积保持不变，并调整气压和流速以获得所需的样品高度。一旦微流体系统建立，断开压缩的气管并关闭注射器泵，直到鼠标准备好进行活体成像。在给小鼠麻醉后，静脉注射TRITC-dextran通过复古轨道路线观察成像过程中的血液循环。

当鼠标放置在苏平位置时，将 70% 乙醇喷洒在头部。使用钳子轻轻抬起头部皮肤，然后用剪刀剪掉大约7平方毫米的皮肤。清洁头皮周围的头发后，从皮肤下取出腹膜，并在头骨上涂上即时粘合剂。

然后附加自定义的头修复器。一旦即时粘合剂变硬，在头部固定器周围涂抹牙科胶水，并通过蓝光照明将其凝固。使用即时胶粘剂将鼠标的下唇粘附在微舌的底部单元上，然后将鼠标放在鼠标制备板上，通过将微舌边缘的孔与柱子对齐，将微舌底部单元固定到保持柱子上。

将鼠标头固定器拧紧到板上的头部固定器支架上，并调整鼠标头与设备之间的距离。然后使用头固定器支架，将鼠标头平稳旋转约 45 度。将鼠标固定在木板上后，使用塑料钳子轻轻地画出它的舌头。

然后使用即时粘合剂，将舌头的腹腔侧连接到微舌头底部单元的上侧。为了保持舌头湿润，用湿棉签擦拭表面，然后将一块浸泡在人工唾液中的组织放在舌头裸露的表面。将弯曲的垫圈放在柱子上，握住微舌的底部，然后将鼠标制备液移动到显微镜阶段。

将鼠标的裸露舌头放置在显微镜目标区域的近似中心下，确保不会偏离舞台的动态范围，然后拧紧螺丝，将鼠标板牢牢地固定在舞台上。在鼠标下放置加热垫，使其体温保持在 36.5 至 37.5 摄氏度之间。为了防止液体进入鼠标气管，在鼠标口腔内放置一块薄薄的扭曲纸，然后取出放置在舌头表面的湿组织，将准备好的微舌头放在鼠舌上，以便通过成像窗口可以看到舌头的表面。

用最小的压缩压力轻轻拧紧两端，确保微舌的安全。要开始获取图像，打开显微镜软件，然后打开 920 纳米双光子激光。将浸水目标安装在显微镜上，然后将目标降低到微舌的成像窗口，并沉浸在目标中。

在相机模式下，通过打开汞灯的蓝光来照亮舌头表面。要找到近似焦点平面，请调整 Z 轴并从纤维形乳胶中搜索自动荧光信号。然后使用 X 和 Y 调整旋钮，定位味蕾。

切换到多光子模式，然后设置激发波长、发射滤波器集、扫描模式和帧大小，以便进行图像采集。在成像窗口的中心，将味蕾周围的血管定位在味蕾高度的三分之二左右，并可视化血液循环。如果血流堵塞，稍微松开固定螺丝以恢复血液流动。

调整 Z 轴，找到含有足够数量味觉细胞的味蕾的 Z 平面，然后在 2 到 6 赫兹进行钙成像，等待 80 秒。成像开始后，打开流体系统的储液库，提供 20 秒的味觉解决方案。经过20秒的味觉刺激，将水库切换回人工唾液。

在成像过程中，等待约三到四分钟的会话之间不断提供人工唾液，以保持舌头湿润和洗去从上一个会话剩余的干面包。皮尔特 - GCAMP6f - tdTomato 小鼠的舌头表面覆盖着自荧光纤维素和稀疏的味蕾。黄色纤维素使用 500 至 550 纳米的照片探测器拍摄，从舌头表面可观察到约 25 微米的深度。

500 至 550 纳米滤镜检测到的绿色 GCaMP 信号和 607 到 670 纳米过滤器检测到的红色 tdTomato 信号表示味觉细胞。tdTomato 信号用于比率指标分析。围绕味蕾的血管是使用胶原蛋白结缔组织中的500至550纳米过滤器获得的，该过滤器在结构上支持味蕾，使用447至460纳米过滤器集获得。

在这个使用钙成像进行体内味觉筛查的代表性示例中，每个味觉细胞都由虚线划定。在这次试验中，细胞2对甜和乌玛米烤面包都有反应。细胞3对低盐和高盐干都做出了反应。

这个味蕾里的细胞都没有对酸味做出反应。由于本实验的目的是观察自然环境中的味觉细胞功能，因此在准备阶段将荧光进入血管并确认其在实验过程中的循环非常重要。