Ce protocole permet d’observer les fonctions des cellules gustatives dans un microenvironnement naturel avec des connexions neuronales et une circulation sanguine restant intactes. Grâce à cette technique, la communication de cellule à cellule peut être étudiée in vivo. Pour commencer, remplissez les réservoirs du système de perfusion à flux pressurisé avec de la salive artificielle et des tastants.
Connectez la conduite d’air comprimé à l’entrée du régulateur et réglez la pression d’air dans le système de distribution fluidique à 30 à 50 livres par pouce carré. Réglez la pression de sortie du régulateur à 0,4 livre par pouce carré et vérifiez si du liquide commence à s’écouler du tube. Connectez le collecteur des réservoirs au port d’entrée de la micro-langue, puis connectez l’orifice de sortie de la micro-langue à une pompe à seringue et retirez le liquide à environ 300 microlitres par minute pour établir une condition d’état d’équilibre.
Confirmez que le volume de la gouttelette suspendue sous la micro languette reste constant et ajustez la pression d’air et le débit pour obtenir la hauteur d’échantillon souhaitée. Une fois le système microfluidique installé, débranchez la conduite d’air comprimé et éteignez la pompe à seringue jusqu’à ce que la souris soit préparée pour l’imagerie in vivo. Après avoir administré l’anesthésie à la souris, injecter par voie intraveineuse TRITC-dextran par une voie rétro-orbitale pour observer la circulation sanguine pendant l’imagerie.
Avec la souris placée en position couchée, vaporisez 70% d’éthanol sur sa tête. Utilisez des pinces pour soulever légèrement la peau de la tête, puis utilisez des ciseaux pour couper environ sept millimètres carrés de peau. Après avoir nettoyé les cheveux autour du cuir chevelu, retirez le périoste sous la peau et appliquez un adhésif instantané sur le crâne.
Fixez ensuite le fixateur de tête personnalisé. Une fois l’adhésif instantané durci, appliquez de la colle dentaire autour du fixateur de tête et solidifiez-le par un éclairage avec une lumière bleue. En utilisant un adhésif instantané pour coller la lèvre inférieure de la souris à l’unité inférieure de la micro langue, puis placez la souris sur la planche de préparation de la souris et fixez l’unité inférieure à la micro langue aux poteaux de maintien en alignant les trous au bord de la micro langue avec les poteaux.
Serrez le fixateur de tête de souris sur le support de fixation de tête sur la carte et ajustez la distance entre la tête de souris et l’appareil. Ensuite, à l’aide du support de fixation de la tête, faites pivoter la tête de la souris en douceur d’environ 45 degrés. Après avoir attaché la souris à la planche, utilisez une pince à épileuse en plastique pour tirer doucement sa langue.
Ensuite, à l’aide d’un adhésif instantané, fixez la face ventrale de la langue à la face supérieure de l’unité inférieure de la micro langue. Pour garder la langue humide, essuyez la surface avec un coton-tige humide, puis placez un morceau de tissu imbibé de salive artificielle sur la surface exposée de la langue. Placez les rondelles incurvées sur les poteaux, en tenant la partie inférieure de la micro langue, puis déplacez la préparation de la souris à l’étape du microscope.
Placez la langue exposée de la souris sous le centre approximatif de la zone d’objectif du microscope, en veillant à ne pas vous écarter de la plage dynamique de la scène, puis serrez les vis pour fixer fermement la carte de la souris sur la scène. Placez un coussin chauffant sous la souris pour maintenir sa température corporelle entre 36,5 et 37,5 degrés Celsius. Pour empêcher le liquide de pénétrer dans la trachée de la souris, placez un mince morceau de papier torsadé dans la bouche de la souris, puis retirez le tissu humide placé à la surface de la langue et placez la micro-langue préparée sur la langue de la souris, de sorte que la surface de la langue soit visible à travers la fenêtre d’imagerie.
Fixez la micro langue en vissant doucement les deux extrémités avec une pression de compression minimale. Pour commencer à acquérir des images, ouvrez le logiciel du microscope, puis allumez le laser à deux photons de 920 nanomètres. Montez l’objectif d’immersion dans l’eau sur le microscope, puis abaissez l’objectif sur la fenêtre d’imagerie de la micro langue et immergez l’objectif.
En mode caméra, illuminez la surface de la langue en allumant la lumière bleue d’une lampe au mercure. Pour trouver le plan focal approximatif, ajustez l’axe Z et recherchez un signal d’autofluorescence provenant des papilles filiformes. Ensuite, à l’aide du bouton de réglage X et Y, localisez une papille gustative.
Passez en mode multiphoton, puis définissez la longueur d’onde d’excitation, le jeu de filtres d’émission, le mode de balayage et la taille de l’image pour l’acquisition d’images. Avec la papille gustative au centre de la fenêtre d’imagerie, localisez les vaisseaux sanguins entourant la papille gustative à environ deux tiers de la hauteur de la papille gustative et visualisez la circulation sanguine. Si le flux sanguin est bouché, desserrer légèrement les vis de fixation pour reprendre le flux sanguin.
Ajustez l’axe Z pour trouver le plan Z d’une papille gustative contenant un nombre suffisant de cellules gustatives, puis procédez à l’imagerie calcique à deux à six Hertz pendant 80 secondes. Après le début de l’imagerie, allumez le réservoir du système fluidique pour fournir une solution de goût pendant 20 secondes. Après 20 secondes de stimulation du goût, revenir au réservoir en salive artificielle.
Pendant l’imagerie, attendez environ trois à quatre minutes entre les séances en fournissant constamment de la salive artificielle pour garder la langue humide et laver le tastant restant de la séance précédente. La surface de la langue de la souris Pirt-GCaMP6f-tdTomato est recouverte de papilles filiformes autofluorescentes et de papilles gustatives peu étalées. Les papilles filiformes en jaune sont capturées à l’aide d’un photodétecteur de 500 à 550 nanomètres et peuvent être observées de la surface même de la langue jusqu’à environ 25 micromètres de profondeur.
Les signaux GCaMP en vert détectés par le filtre de 500 à 550 nanomètres et les signaux tdTomato en rouge, détectés par le filtre de 607 à 670 nanomètres, représentent les cellules gustatives. Le signal tdTomato est obtenu pour l’analyse métrique du ratio. Les vaisseaux sanguins qui entourent la papille gustative sont acquis à l’aide du filtre de 500 à 550 nanomètres situé dans le tissu conjonctif de collagène, qui soutient structurellement la papille gustative, est acquis à l’aide de l’ensemble de filtres de 447 à 460 nanomètres.
Dans cet exemple représentatif de dépistage du goût in vivo à l’aide de l’imagerie calcique, chaque cellule gustative est délimitée par des lignes pointillées. Dans cet essai, la cellule 2 a répondu à la fois aux tastants sucrés et umami. Et la cellule 3 a répondu à la fois à des tastants à faible et à haute teneur en sel.
Aucune des cellules de cette papille gustative n’a répondu aux goûts acides. Étant donné que le but de cette expérience est d’observer le goût de la fonction cellulaire dans l’environnement naturel, il est important de délivrer les fluorescents dans les vaisseaux sanguins à l’étape de préparation et de confirmer leur circulation pendant l’expérience.
