이 프로토콜은 신경 연결 및 혈액 순환이 그대로 남아있는 자연 미세 환경에서 맛 세포의 기능을 관찰 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 세포 간 통신을 생체 내에서 조사할 수 있습니다. 먼저 가압 된 흐름 관류 시스템의 저장소를 인공 타액과 술로 채웁니다.
압축 공기 라인을 레귤레이터 입력에 연결하고 유체 전달 시스템의 공기 압력을 평방 인치당 30~50파운드로 설정합니다. 레귤레이터의 출력 압력을 평방 인치당 0.4 파운드로 설정하고 액체가 튜브에서 유입되기 시작하는지 확인합니다. 저수지에서 마이크로 혀의 입력 포트에 저수지에서 매니폴드를 연결한 다음 마이크로 혀의 출력 포트를 주사기 펌프에 연결하고 분당 약 300 마이크로리터에서 액체를 인출하여 안정된 상태 상태를 확립합니다.
마이크로 혀 아래에 매달려 있는 액적의 부피가 일정하게 유지되고 기압과 유량을 조절하여 원하는 시료 높이를 얻는지 확인한다. 미세 유체 시스템이 설정되면 압축 공기 라인을 분리하고 마우스가 생체 이미징에 대비할 때까지 주사기 펌프를 끕드합니다. 마우스에 마취를 투여 한 후, 정맥 내 화상 진찰 중에 혈액 순환을 관찰하는 복고풍 궤도 경로를 통해 TRITC-dextran을 주입합니다.
마우스를 수핀 위치에 놓고 머리에 70%에탄올을 뿌린다. 집게를 사용하여 머리 피부를 가볍게 들어 올린 다음 가위를 사용하여 약 7 평방 밀리미터의 피부를 잘라내세요. 두피 주위의 모발을 청소한 후 피부 아래에서 골막염을 제거하고 두개골에 즉시 접착제를 발라주세요.
그런 다음 사용자 정의 헤드 픽서를 연결합니다. 즉각적인 접착제가 경화되면 머리 해결사 주위에 치과 접착제를 바르고 청색 광으로 조명하여 고화시하십시오. 인스턴트 접착제를 사용하여 마우스의 하부 입술을 마이크로 혀의 하단 유닛에 붙인 다음 마우스 준비 보드에 마우스를 배치하고 마이크로 혀의 가장자리에 구멍을 기둥과 정렬하여 마이크로 혀의 하단 유닛을 홀드 포스트에 고정시합니다.
마우스 헤드 픽서를 보드의 헤드 픽서 홀더에 조이고 마우스 헤드와 장치 사이의 거리를 조정합니다. 그런 다음 헤드 픽서 홀더를 사용하여 마우스 헤드를 약 45도 부드럽게 회전시합니다. 보드에 마우스를 고정 한 후, 부드럽게 혀를 그릴 플라스틱 핀셋을 사용합니다.
그런 다음 즉각적인 접착제를 사용하여 혀의 복부 면을 미세 혀의 하단 유닛의 상부에 부착합니다. 혀를 촉촉하게 유지하려면 젖은 면봉으로 표면을 닦은 다음 혀의 노출 된 표면에 인공 타액에 담근 조직 조각을 놓습니다. 곡면 와셔를 기둥에 놓고 마이크로 혀의 아래부분을 잡은 다음 마우스 준비를 현미경 단계로 옮습니다.
현미경 목표 영역의 대략적인 중심 아래에 마우스의 노출된 혀를 배치하고, 스테이지의 동적 범위에서 벗어나지 않도록 한 다음 나사를 조여 스테이지에 마우스 보드를 단단히 부착합니다. 36.5에서 섭씨 37.5도 사이의 체온을 유지하기 위해 마우스 아래에 가열 패드를 놓습니다. 액체가 마우스 기관지에 들어가는 것을 방지하기 위하여는, 마우스의 입 안쪽에 뒤틀린 종이의 얇은 조각을 놓고, 혀의 표면에 놓인 젖은 조직을 제거하고 마우스 혀에 준비된 마이크로 혀를 놓습니다, 혀의 표면이 화상 진찰 창을 통해 볼 수 있도록.
최소한의 압축 압력으로 양 끝을 부드럽게 나사로 고정하여 마이크로 혀를 고정하십시오. 이미지를 획득하기 시작하려면 현미경 소프트웨어를 열고 920 나노미터 2 광자 레이저를 켭니다. 현미경에 물 침지 목표를 탑재한 다음 마이크로 혀의 이미징 창에 목표를 낮추고 목표를 담급하십시오.
카메라 모드에서는 수은 램프에서 파란색 광등에서 파란색 빛을 켜혀 표면을 비춥습니다. 대략적인 초점 평면을 찾으려면 Z축을 조정하고 필리폼 유두에서 자동 불발 신호를 검색합니다. 그런 다음 X 및 Y 조정 노브를 사용하여 미각을 찾습니다.
멀티 광자 모드로 전환한 다음 이미지 수집을 위해 여기 파장, 방출 필터 세트, 스캔 모드 및 프레임 크기를 설정합니다. 이미징 창의 중앙에 미각을 사용하면 미각의 높이의 약 3분의 2에서 미각을 둘러싼 혈관을 찾아 혈액 순환을 시각화합니다. 혈류가 막히면 고정 나사를 약간 풀어 혈액 흐름을 재개합니다.
Z축을 조정하여 충분한 수의 미각 세포를 포함하는 미각의 Z 평면을 찾은 다음 80초 동안 2~6헤르츠에서 칼슘 이미징을 진행합니다. 이미징이 시작된 후 유체 시스템의 저장소를 켜서 20초 동안 맛 용액을 제공합니다. 20초의 맛 자극 후, 저수지를 인공 타액으로 다시 전환합니다.
이미징 하는 동안, 지속적으로 인공 타액을 제공 하는 세션 사이 약 3 ~ 4 분 동안 대기 하 고 혀를 촉촉 하 게 유지 하 고 이전 세션에서 남아 있는 태들을 씻어. Pirt-GCaMP6f-tdTomato 마우스의 혀 표면은 자동 형광 성 필기포 유두로 덮여 있으며 드물게 입맛을 퍼뜨리습니다. 노란색의 필리폼 유두는 500 내지 550 나노미터의 사진 검출기를 사용하여 포획되며 혀의 표면에서 약 25 마이크로미터 깊이까지 관찰할 수 있습니다.
녹색의 GCaMP 신호는 500 내지 550 나노미터 필터와 tdTomato 신호에 의해 검출되었으며, 607 내지 670 나노미터 필터에 의해 검출된 적색으로, 미각 세포를 나타낸다. tdTomato 신호는 비율 메트릭 분석을 위해 얻어진다. 미각을 둘러싸고 있는 혈관은 구조적으로 미각을 지원하는 콜라겐 결합 조직에 설정된 500 내지 550 나노미터 필터를 사용하여 획득되며, 447 내지 460 나노미터 필터 세트를 사용하여 획득된다.
칼슘 이미징을 이용한 생체 내 맛 스크리닝의 대표적인 예에서 각 맛 세포는 파선에 의해 구분됩니다. 이 예심에서는, 세포 2는 달콤하고 감칠맛 tastants 둘 다에 반응했습니다. 그리고 세포 3은 저염과 높은 염분술사 모두에 반응했다.
이 미각의 세포중 어느 것도 신맛에 반응하지 않았습니다. 본 실험의 목적은 자연 환경에서 맛의 세포 기능을 관찰하기 위한 것이므로, 실험 단계에서 혈관내형광을 전달하고 순환을 확인하는 것이 중요하다.
