Bu protokol, sinirsel bağlantılar ve kan dolaşımı bozulmadan kalan doğal bir mikroçevrimde tat hücrelerinin işlevlerini gözlemlemeye izin verir. Bu teknik kullanılarak hücreden hücreye iletişim in vivo olarak araştırılabilir. Başlamak için, basınçlı akış perfüzyon sisteminin rezervuarlarını yapay tükürük ve şok tabancaları ile doldurun.
Basınçlı hava hattını regülatör girişine bağlayın ve akışkan dağıtım sistemindeki hava basıncını inç kare başına 30 ila 50 pounda ayarlayın. Regülatörün çıkış basıncını inç kare başına 0,4 pound olarak ayarlayın ve sıvının tüpten akmaya başlayıp başlamay olduğunu kontrol edin. Manifoldu rezervuarlardan mikro dilin giriş portuna bağlayın, ardından mikro dilin çıkış portu bir şırınga pompasına bağlayın ve sabit bir durum durumu oluşturmak için sıvıyı dakikada yaklaşık 300 mikrolitrede çekin.
Mikro dilin altında asılı damlacığın hacminin sabit kaldığını onaylayın ve istenen numune yüksekliğini elde etmek için hava basıncını ve akış hızını ayarlayın. Mikroakışkan sistem kurulduktan sonra basınçlı hava hattını çıkarın ve fare in vivo görüntüleme için hazırlanana kadar şırınga pompasını kapatın. Fareye anestezi uyguladıktan sonra, görüntüleme sırasında kan dolaşımını gözlemlemek için TRITC-dektranı retro yörüngesel bir yoldan intravenöz olarak enjekte edin.
Fare geri zeka pozisyonuna yerleştirilmişken, kafasına% 70 etanol püskürtün. Baş derisini hafifçe kaldırmak için tokmaklar kullanın, ardından yaklaşık yedi milimetre kare deriyi kesmek için makas kullanın. Saç derisinin etrafındaki saçları temizledikten sonra, periosteumu cildin altından çıkarın ve kafatasına anında bir yapıştırıcı uygulayın.
Ardından özelleştirilmiş kafa düzelticiyi takın. Anında yapıştırıcı sertleştikten sonra, baş düzelticinin etrafına diş yapıştırıcısı uygulayın ve mavi ışıkla aydınlatarak katılaştırın. Farenin alt dudağını mikro dilin alt birimine yapıştırmak için anında yapıştırıcı kullanarak fareyi fare hazırlama tahtasına yerleştirin ve mikro dilin kenarındaki delikleri direklerle hizalayarak mikro dildeki alt üniteyi tutma noktalarına sabitleyin.
Fare kafası düzelticisini tahtadaki kafa düzeltici tutucusuna sıkın ve fare kafası ile cihaz arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ardından, kafa düzeltici tutucuyu kullanarak fare kafasını yaklaşık 45 derece döndürün. Fareyi tahtaya sabitledikten sonra, dilini nazikçe çizmek için plastik cımbız kullanın.
Daha sonra anında yapıştırıcı kullanarak, dilin ventral tarafını mikro dilin alt ünitesinin üst tarafına takın. Dili nemli tutmak için, yüzeyi ıslak bir pamuklu çubukla silin, ardından dilin açık yüzeyine suni tükürük içine batırılmış bir doku parçası yerleştirin. Kavisli pulları mikro dilin alt kısmını tutarak direklere yerleştirin, ardından fare hazırlığını mikroskop aşamasına getirin.
Farenin açık dilini mikroskop nesnel alanının yaklaşık merkezinin altına yerleştirin, aşamanın dinamik aralığından sapmamaya dikkat edin, ardından fare tahtasını sahneye sıkıca takmak için vidaları sıkın. Vücut sıcaklığını 36,5 ila 37,5 santigrat derece arasında korumak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Sıvının fare nefes borusuna girmesini önlemek için, farenin ağzının içine ince bir bükülmüş kağıt parçası yerleştirin, ardından dilin yüzeyine yerleştirilen ıslak dokuyu çıkarın ve hazırlanan mikro dili, dilin yüzeyinin görüntüleme penceresinden görülebilecek şekilde fare diline yerleştirin.
Her iki ucını da minimum basınç basıncıyla hafifçe vidalayarak mikro dili sabitleyin. Görüntü almaya başlamak için mikroskop yazılımını açın, ardından 920 nanometre iki foton lazeri açın. Su daldırma hedefini mikroskop üzerine monte edin, ardından hedefi mikro dilin görüntüleme penceresine diraye bırakın ve hedefi daldırın.
Kamera modunda, bir cıva lambasından mavi ışığı açarak dilin yüzeyini aydınlatın. Yaklaşık odak düzlemini bulmak için Z eksenini ayarlayın ve filiform papilladan bir otofluoresans sinyali arayın. Ardından X ve Y ayar düğmesini kullanarak bir tat alma tomurcuk bulun.
Çoklu foton moduna geçin, ardından görüntü alımı için heyecan dalga boyunu, emisyon filtresi kümesini, tarama modunu ve çerçeve boyutunu ayarlayın. Görüntüleme penceresinin ortasındaki tat alma tomurcukları ile, tat tomurcukunun yaklaşık üçte iki yüksekliğinde tat tomurcukunu çevreleyen kan damarlarını bulun ve kan dolaşımını görselleştirin. Kan akışı tıkanırsa, kan akışına devam etmek için sabitleme vidalarını hafifçe gevşetin.
Yeterli sayıda tat hücresi içeren bir tat tomurcukunun Z düzlemini bulmak için Z eksenini ayarlayın, ardından 80 saniye boyunca iki ila altı Hertz'de kalsiyum görüntülemeye devam edin. Görüntüleme başladıktan sonra, 20 saniye boyunca bir tat çözeltisi sağlamak için akışkan sistemin rezervuarını kapatın. 20 saniyelik tat stimülasyonundan sonra rezervuarı tekrar yapay tükürük sınayın.
Görüntüleme sırasında, dili nemli tutmak ve önceki seanstan kalan ıslıyı yıkamak için sürekli olarak yapay tükürük sağlayan seanslar arasında yaklaşık üç ila dört dakika bekleyin. Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresinin dil yüzeyi otofluoresan filiform papilla ve seyrek yayılmış tat tomurcukları ile kaplıdır. Sarı filiform papilla, 500 ila 550 nanometrede bir fotoğraf dedektörü kullanılarak yakalanır ve dilin yüzeyinden yaklaşık 25 mikrometre derinliğe kadar gözlemlenebilir.
500 ila 550 nanometre filtre tarafından algılanan yeşildeki GCaMP sinyalleri ve 607 ila 670 nanometre filtresi tarafından algılanan kırmızı tdTomato sinyalleri tat hücrelerini temsil eder. TdTomato sinyali oran ölçüm analizi için elde edilir. Tat alma tomurcuklarını çevreleyen kan damarları, tat tomurcuklarını yapısal olarak destekleyen kollajen bağ dokusunda ayarlanan 500 ila 550 nanometre filtre seti kullanılarak elde edilir.
Kalsiyum görüntüleme kullanılarak in-vivo tat taramasının bu temsili örneğinde, her tat hücresi kesik çizgilerle çizilir. Bu denemede, hücre 2 hem tatlı hem de umami tastantlarına yanıt verdi. Ve hücre 3 hem düşük hem de yüksek tuz lekelerine cevap verdi.
Bu tat tomurcuklarındaki hücrelerin hiçbiri ekşi tatlara cevap vermedi. Bu deneyin amacı doğal ortamda tat hücre fonksiyonunu gözlemlemek olduğundan, floresanların hazırlık adımında kan damarlarına teslim etmek ve deney sırasında dolaşımını onaylamak önemlidir.
