Este protocolo permite observar as funções das células de paladar em um microambiente natural com conexões neurais e circulação sanguínea permanecendo intacta. Usando essa técnica, a comunicação célula-celular pode ser investigada in vivo. Para começar, encha os reservatórios do sistema de perfusão de fluxo pressurizado com saliva artificial e tastants.
Conecte a linha de ar comprimido à entrada do regulador e coloque a pressão de ar no sistema de entrega fluidica para 30 a 50 libras por polegada quadrada. Defina a pressão de saída do regulador para 0,4 libras por polegada quadrada e verifique se o líquido começa a fluir para fora do tubo. Conecte o coletor dos reservatórios à porta de entrada da micro-língua, depois conecte a porta de saída da micro língua a uma bomba de seringa e retire o líquido a aproximadamente 300 microliters por minuto para estabelecer uma condição de estado estável.
Confirme que o volume da gotícula pendurada sob a micro língua permanece constante e ajuste a pressão de ar e a taxa de fluxo para obter a altura amostral desejada. Uma vez configurado o sistema microfluido, desconecte a linha de ar comprimido e desligue a bomba de seringa até que o mouse esteja preparado para imagens in vivo. Depois de administrar anestesia ao camundongo, injete intravenosamente tritc-dextran através de uma rota retro-orbital para observar a circulação sanguínea durante a imagem.
Com o mouse colocado em uma posição supina, borrife 70% de etanol na cabeça. Use fórceps para levantar a pele da cabeça levemente, em seguida, use a tesoura para cortar aproximadamente sete milímetros quadrados de pele. Depois de limpar o cabelo ao redor do couro cabeludo, remova o periósteo debaixo da pele e aplique um adesivo instantâneo no crânio.
Em seguida, anexe o fixador de cabeça personalizado. Uma vez que o adesivo instantâneo é endurecido, aplique cola dentária ao redor do fixador da cabeça e solidifice-o por iluminação com uma luz azul. Usando adesivo instantâneo para colar o lábio inferior do mouse à unidade inferior da micro língua, em seguida, colocou o mouse na placa de preparação do mouse e segurou a unidade inferior na micro língua para os postes de redo pé, alinhando os orifícios na borda da micro língua com os postes.
Aperte o fixador da cabeça do mouse no suporte do fixador da cabeça na placa e ajuste a distância entre a cabeça do mouse e o dispositivo. Em seguida, usando o suporte do fixador de cabeça, gire a cabeça do mouse suavemente em aproximadamente 45 graus. Depois de fixar o mouse na placa, use pinças de plástico para desenhar sua língua suavemente.
Em seguida, usando adesivo instantâneo, conecte o lado ventral da língua ao lado superior da unidade inferior da micro-língua. Para manter a língua úmida, limpe a superfície com um cotonete molhado e coloque um pedaço de tecido encharcado em saliva artificial na superfície exposta da língua. Coloque as arruelas curvas nos postes, segurando a parte inferior da micro-língua, em seguida, mova a preparação do mouse para o estágio do microscópio.
Posicione a língua exposta do mouse sob o centro aproximado da área objetiva do microscópio, certificando-se de não desviar da faixa dinâmica do palco e, em seguida, aperte os parafusos para fixar firmemente a placa do mouse no palco. Coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter sua temperatura corporal entre 36,5 e 37,5 graus Celsius. Para evitar que o líquido entre na traqueia do rato, coloque um fino pedaço de papel torcido dentro da boca do rato, em seguida, remova o tecido molhado colocado na superfície da língua e coloque a micro língua preparada na língua do rato, de tal forma que a superfície da língua seja visível através da janela de imagem.
Fixar a micro-língua paraparando suavemente ambas as extremidades com pressão compressiva mínima. Para começar a adquirir imagens, abra o software do microscópio e ligue o laser de 920 nanômetros de dois fótons. Monte o objetivo de imersão de água no microscópio, depois baixe o objetivo na janela de imagem da micro língua e mergulhe o objetivo.
No modo câmera, ilumine a superfície da língua ligando a luz azul de uma lâmpada de mercúrio. Para encontrar o plano focal aproximado, ajuste o eixo Z e procure um sinal de autofluorescência a partir da papila filiforme. Em seguida, usando o botão de ajuste X e Y, localize uma papila gustativa.
Mude para o modo multifótons e, em seguida, defina o comprimento de onda de excitação, o conjunto de filtros de emissão, o modo de varredura e o tamanho do quadro para aquisição de imagens. Com a papila gustativa no centro da janela de imagem, localize os vasos sanguíneos ao redor da papila gustativa em cerca de dois terços da altura da papila gustativa e visualize a circulação sanguínea. Se o fluxo sanguíneo estiver entupido, solte ligeiramente os parafusos de fixação para retomar o fluxo sanguíneo.
Ajuste o eixo Z para encontrar o plano Z de uma papila gustativa contendo um número adequado de células gustativas, em seguida, proceda com imagens de cálcio em dois a seis Hertz por 80 segundos. Após o início da imagem, ligue o reservatório do sistema fluido para fornecer uma solução de sabor por 20 segundos. Após 20 segundos de estimulação do sabor, mude o reservatório de volta para saliva artificial.
Durante a imagem, espere cerca de três a quatro minutos entre as sessões fornecendo consistentemente saliva artificial para manter a língua úmida e lavar o tastant restante da sessão anterior. A superfície da língua do mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato é coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes e papilas gustativas pouco espalhadas. As papilas filiformas em amarelo são capturadas usando um detector de fotos a 500 a 550 nanômetros e podem ser observadas desde a própria superfície da língua até aproximadamente 25 micrômetros de profundidade.
Os sinais GCaMP em verde detectados pelo filtro de 500 a 550 nanômetros e os sinais tdTomato em vermelho, detectados pelo filtro de 607 a 670 nanômetros, representam as células gustiáveis. O sinal tdTomato é obtido para análise métrica de razão. Os vasos sanguíneos que circundam a papila gustativa são adquiridos usando o filtro de 500 a 550 nanômetros fixado no tecido conjuntivo de colágeno, que sustenta estruturalmente a papila gustativa, é adquirido usando o conjunto de filtros de 447 a 460 nanômetros.
Neste exemplo representativo de rastreamento de sabor in vivo usando imagem de cálcio, cada célula de sabor é demarcada por linhas tracejadas. Neste ensaio, a célula 2 respondeu aos tastants doces e umami. E a célula 3 respondeu aos tastantes de sal baixo e alto.
Nenhuma das células deste paladar respondeu aos gostos azedos. Uma vez que o objetivo deste experimento é observar a função celular do paladar no ambiente natural, é importante entregar os fluorescentes nos vasos sanguíneos na etapa de preparação e confirmar sua circulação durante o experimento.
