在靶标和标记下使用裂解分析植物中的H3K4me3修饰

该实验的总体目标是在整个基因组中鉴定与蛋白质相关的DNA片段，这反映了染色质的状态。为了实现这一目标，进行了三次特殊行动。首先，从植物细胞中分离出完整的细胞核。

其次，染色质的修饰被特异性抗体原位识别。第三，抗体拴系蛋白A-转座酶融合蛋白Tn5转座酶，在镁离子的活化下原位裂解染色质。然后将DNA片段和染色质修饰结合位点与适配器整合，并准备好进行DNA制备。

聚合酶链反应富集增强了生成测序。细胞水平上的表观基因组学调控，包括DNA和组蛋白修饰，转录因子的行为以及与其募集蛋白的非编码RNA，导致基因表达的时间和空间控制。Henikoff实验室开发的CUT&Tag技术是一种酶系留方法，用于高效染色质表观基因组学分析。

在这里，我们使用棉叶作为实验材料，并使用组蛋白H3赖氨酸-4三甲基化的抗体进行染色质分析作为示例。我们为工厂的CUT&Tag性能提供了一个改进的协议和视频。对于使用CUT&Tag的每种样品制备，收集克棉花叶组织。

将叶片用液氮研磨成细粉，并转移到含有25 mL冷冻核隔离缓冲液A的50 mL猎鹰管中，将缓冲溶液轻轻混合，并将管在冰上孵育5分钟，轻轻摇晃以均匀分散物料。然后以500相对离心力或rcf，在4摄氏度下旋转5分钟，形成细胞沉淀。倾析上清液，沉淀用20mL冷冻核分离缓冲液B重悬，补充0.5%Triton。

将管轻轻倒置以完全重悬沉沉淀。然后将所得的细胞裂解物用两个筛子的组合过滤，在顶部使用500目筛子除去较大的组织碎片。在底部使用1000目筛子来收集原子核。

筛子的适当网孔尺寸的选择取决于植物核的大小。在筛子的背面使用无菌滤纸来吸收部分裂解物和小细胞碎片。将含有细胞核的裂解物转移到新鲜的1.5毫升离心管中，并在300 rcf下旋转4分钟，在4摄氏度下收集细胞核。

离心后，使用移液器吸头尽可能多地去除上清液。用量为800微升，加入核洗涤缓冲液。并将管轻轻倒置以重悬原子核。

管子在300 rcf下再次旋转，在4摄氏度下旋转四分钟。在总共三次洗涤后，将所得的细胞核在新鲜的1.5毫升离心管中混合，并以300 rcf旋转，在4摄氏度下旋转4分钟。使用移液器吸头尽可能多地去除剩余的缓冲液。

下一步是抗体的孵育。将50微升细胞核的等分试样重悬于1毫升抗体缓冲液中，并补充有EDTA，BSA，蛋白酶抑制剂混合物在洋地黄素中。将150微升的等分试样置于新鲜的1.5毫升管中进行一次反应，向每个管中加入两微升抗体。

在该测定中，添加抗体后建立了抗组蛋白-H3-赖氨酸-4-三甲基化抗体和免疫球蛋白G阴性对照组的两个生物重复。将溶液轻轻混合，并将管子放在水平振荡器上，以12rpm在4摄氏度下杂交过夜。第二天早上，取出管子，使用800微升免疫沉淀洗涤缓冲液洗涤细胞核。

将管轻轻倒置以进行混合，并在室温下以12rpm将其放在水平振荡器上五分钟。洗涤后，管子在4摄氏度下以300 rcf旋转四分钟。离心后，使用移液器吸头除去上清液。

重复了三次洗涤。第三次洗涤后，将管子在四摄氏度下旋转300 rcf两分钟，并使用移液器吸头尽可能多地去除剩余的缓冲液。制备用于孵育的Tn5转座酶混合物。

将一微升转座酶加入到每150微升转座酶培养缓冲液中。我们建议根据反应次数首先制备转座酶溶液混合物。然后向每个管中加入150微升的等分试样。

将溶液轻轻混合，并在室温下以12rpm的水平振荡器放置两小时。每10至15分钟轻轻混合一次管子。孵育后，使用800微升免疫沉淀洗涤缓冲液在室温下洗涤细胞核三次，以除去未结合的Tn5转座酶。

第三次洗涤后，将管子在4摄氏度下以300 rcf旋转两分钟，并使用移液器吸头除去剩余的缓冲液。对于标记步骤，向反应管中加入300微升的标记缓冲液。将溶液充分混合，在37摄氏度下孵育一小时。

孵育后，加入10微升0.5摩尔/升EDTA在30微升10%SDS下测定反应。接下来加入300微升DNA提取缓冲液。进行不规则的DNA提取。

DNA片段溶解在25微升无菌水中。24微升用于NGS文库构建中的PCR扩增。该图显示了带有DAPI成像的完整细胞核染色剂，在显微镜下获得足够数量的完整且相对干净的细胞核是CUT&Tag的关键步骤。

PCR后，转移两微升，并在1.5%琼脂糖凝胶上检查DNA的大小。该图显示与免疫球蛋白基因阴性对照相比。来自组蛋白H3赖氨酸4三甲基化样品的大部分DNA片段应为280至500个碱基对。

DNA片段可以被纯化，然后通过高通量测序进行分析。该图显示了抗组蛋白H3赖氨酸4三甲基化抗体与免疫球蛋白G阴性对照组的结果生成测序。与ChIP-seq相比，该技术使用少量细胞以高分辨率和极低背景生成DNA文库，并且程序简化。

CUT&Tag是一种新方法，仍在进行中。