本协议适用于肝硬化的研究，以及肝病，代谢，合成和毒化途径在硬化的背景下的研究。这种方法的主要优点是其可重复性和获得成果所需的时间短。再加上它提供了两个级别的硬化，轻度和严重。
体外诱发的硬化可能为确定诊断疾病的潜在标记以及治疗目标提供证据。此方法旨在应用于硬化结果。然而，它可以调整到广泛的不同细胞受脂质过度暴露的影响，如在肥胖和脂质血症期间。
准备标准 RPMI 1640。补充RPMI 1640培养基与10%的热激活FBS，和1%的青霉素链霉素溶液。使用 0.22 微米过滤器对它进行消毒，并将补充剂存储在 4 摄氏度。
要准备棕榈酸盐库存溶液，在标准RPMI 1640中准备50毫摩尔的棕榈酸盐溶液，并辅以1%的无脂 BSA。使用 0.22 微米过滤器对库存溶液进行约 5 到 10 毫升的消毒，并将储存在 4 摄氏度的高温下，防止光线照射长达一个月。要准备油酸盐库存溶液，应在补充的 RPMI 1640 中准备 50 毫摩尔油酸盐溶液。
使用 0.22 微米过滤器对库存溶液进行消毒。将其存放在零下20摄氏度，保护光线长达一个月。要从先前准备的库存中制备造血介质，应准备 100 毫米的 50 微摩尔混合物，其中一部分为棕榈酸盐，另一种为油酸盐。
对于温和水平，在标准RPMI 1640中倒入500微摩尔混合物，其中一部分为棕榈酸盐，两部分油酸盐为严重水平。使用 0.22 微米过滤器进行消毒。在摄氏四度下储存长达一周。
或者，使用免费脂质白蛋白，用各自的脂肪酸制备库存溶液，将棕榈酸或油酸盐溶解在两毫升绝对乙醇中，然后混合在标准RPMI 1640的最终体积中。通过存储在标准RPMI 1640培养介质中直接溶解油酸盐。允许乙醇蒸发，在70摄氏度的水浴中孵化，并彻底混合。
使用 0.22 微米过滤器对两种库存溶液进行消毒，并将棕榈酸库存溶液存储在 4 摄氏度。并在零下20摄氏度的油酸盐库存溶液。在 24 井板中每口油井可容纳 010 万个 Hep G2 细胞。
添加一毫升标准RPMI 1640。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育24小时，允许细胞附着。培养前后，丢弃标准RPMI 1640介质。
并添加造质介质。丢弃超高超，每24小时添加一次新鲜的造菌介质。为了执行生存能力和形态评估，通过添加 500 微升 0.05% 试穿 EDTA，将超纳米和分离细胞从井中分离。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育5分钟。在微管中收集重新悬存的细胞。离心机的离心机为300倍G.然后丢弃超高音，加入200微升的标准RPMI 1640，并重新悬浮细胞。
在新鲜的微管中加入 15 微升 0.4% 的试穿蓝色溶液。添加并混合前一个单元格悬浮器的 15 微升。在血细胞计中计算染色细胞和非染色细胞，并计算生存能力和死亡率。
将细胞培养盖滑入24井板中的每口井中，并按文本手稿中描述种子 Hep G2 细胞。适当孵化后，用一毫升PBS清洗细胞，并丢弃超高分子。在PBS中将它们与一毫升4%的乙醛混合，在室温下孵育一小时。
丢弃多余的副甲醛，用一毫升蒸馏水冲洗细胞。然后加入一毫升70%异丙酚，孵育5分钟。丢弃多余的异丙酚，加入一毫升油红O溶液，孵育30分钟。
丢弃多余的油红 O 溶液，然后用一毫升蒸馏水冲洗。以400倍的放大倍数观察显微镜下的细胞。随机从井的整个区域选择并捕获 10 个光学场的照片。
重复每口井的成像。要评估红色染色区域的百分比，请打开 ImageJ 软件并导入所需的文件，然后单击调整和使用颜色阈值"工具，定义红色检测的色调参数。然后调整图像的饱和度和亮度。
使用分析粒子"工具"将染色区域与光学场的完整区域进行比较，并计算每口油井的平均百分比。在24口井板中每口油井可容纳10万肝细胞，可提供最佳的汇合度。随着文化时间的增加，生存能力逐渐减弱，在严重硬化的四天里达到60%的最低点。
因此，在造菌条件下培养的肝细胞的死亡率较高。随着接触脂质的时间，它逐渐增加。由于增殖，细胞数量逐渐增加。
然而，在三天和四天轻度硬化中，增殖率较低。相比之下，严重的硬化与24小时的低增殖有关。用油红 O 染色细胞表明，在造血条件下培养的细胞中，脂质液滴至少增加了两倍。
细胞内脂肪根据在造菌介质中接触培养物的时间而增加。在轻度硬化中，脂质含量从第二天开始增加，而在严重硬化中，从24小时开始，脂质含量显著高。细胞培养需要以前的经验。
在使用此协议之前，在标准条件下培养 Hep G2 细胞可能会有所帮助。脂肪酸库存的准备也是一个关键点。棕榈酸在室温下是固体，在管理之前需要加热。
这种方法应允许对不同的途径进行分子分析，包括但不限于增殖、凋亡、自噬、氧化应激以及药理学和毒理学分析。
