Questo è il primo protocollo che dimostra il successo della co-infezione del tratto corticospinale nei ratti neonatali. Fornisce un modello accurato per studiare come le singole sottopopolazioni di cellule nei giovani mammiferi contribuiscono al recupero dalle lesioni del midollo spinale. Come altre tecniche di doppio vettore virale, questo metodo consente all'utente di trasdurre con precisione specifiche sottopopolazioni di neuroni, a sua volta, consentendo ai ricercatori di identificare l'efficacia di varie tecniche chemiogenetiche nel promuovere il recupero.
Ci aspetteremmo che i ricercatori che non hanno familiarità con questa tecnica abbiano difficoltà a localizzare la corretta anatomia spinale. E quindi ti incoraggiamo a contare continuamente i segmenti vertebrali spesso e a fare sempre riferimento ai tuoi punti di riferimento. Dopo aver confermato la profondità dell'anestesia in un cucciolo neonatale di Sprague Dawley, identificare l'area in cui verrà eseguita l'incisione premendo la pinza nella linea mediana sulla parte superiore del cuoio capelluto, sentendo la sutura sagittale.
Tenendo la pelle tesa per garantire un'incisione pulita, dritta e precisa, praticare un'incisione di un centimetro lungo il piano di sutura sagittale iniziando immediatamente sopra la linea I. Successivamente, identificare il bregma sondando delicatamente le pinze lungo la superficie del cranio, prestando molta attenzione alle linee di sutura e a una rientranza causata dal forcipe che corre lungo le ossa parietali e frontali. Mantenere l'apertura applicando ganci ponderati sul lato di interesse.
Eliminare l'aponeurosi utilizzando una combinazione di punte di cotone e micro forbici per massimizzare l'esposizione del bregma per una maggiore precisione. Assicurarsi che la sutura coronale sia in chiara vista abbastanza lontano lateralmente da fornire un modello approssimativo per le iniezioni successive. Usando le micro forbici, ritagliare una sezione di circa tre metri per due dell'osso frontale sinistro del cranio immediatamente adiacente al bregma.
Eliminare eventuali detriti, liquido cerebrospinale e sangue con punte di cotone. Per iniettare il virus, posizionare l'ago in posizione e programmare l'iniettore per iniettare un microlitro ad una velocità di 250 nanolitri al minuto. Al termine dell'iniezione, lasciare riposare l'ago nella corteccia per tre minuti.
Ripetere le iniezioni alle altre coordinate per un totale di tre iniezioni lungo la corteccia in relazione al bregma, il tutto ad una profondità di 0,6 millimetri. Dopo aver completato le iniezioni, suturare il cuoio capelluto e trasferire l'animale sull'altro tavolo operatorio per la laminectomia cervicale. Palpare la base del cranio usando le dita per identificare il sito di incisione.
Tenere la pelle tesa applicando tensione con il pollice e l'indice. Utilizzando una lama numero 11, iniziare l'incisione sulla linea mediana da uno a due millimetri posteriormente alla base del cranio ed estendere l'incisione di un centimetro indietro per esporre il muscolo superficiale. Usando la punta affilata della lama, effettuare delicatamente una serie di tagli lungo la linea mediana del muscolo superficiale per esporre la cavità spinale e i muscoli spinali profondi.
Quindi utilizzare un paio di pinze per aprire il muscolo e visualizzare la finestra chirurgica. Una volta che i muscoli spinali profondi sono stati esposti, inserire i divaricatori nella finestra chirurgica e ritrarre la finestra chirurgica a sette-otto millimetri di larghezza, consentendo una visione senza ostacoli della colonna vertebrale. Identificare la seconda vertebra cervicale dal suo processo spinoso prominente che proietta dorsalmente e incapsula un grande muscolo a forma di cupola.
Utilizzando il bordo piatto di un raschietto osseo, raschiare delicatamente via il muscolo spinale profondo ai lati per esporre le vertebre da C3 a C7. Inizia mediale e raschia lateralmente lungo la direzione parallela alle lamine delle vertebre per garantire una corretta esposizione, consentendo una chiara distinzione delle lamine vertebrali. Controlla qualsiasi sanguinamento con punte di cotone.
Usando C2 come guida quando si contano i livelli vertebrali, tagliare con cura i bordi laterali delle lamine cartilaginee a C6 e C7 usando un paio di micro forbici. Utilizzando un paio di pinze sottili, rimuovere con attenzione la parte sezionata della lamina per esporre il midollo spinale, assicurandosi che la finestra spinale sia abbastanza grande da ospitare il sito di iniezione desiderato. Posiziona l'animale nel supporto cranico stereotassico e posiziona un pezzo di garza arrotolato sotto il tronco dell'animale per sollevare i suoi quarti posteriori.
Prima di iniziare le iniezioni, liberare la finestra spinale da qualsiasi sangue o liquido cerebrospinale applicando delicatamente punte di cotone e triangoli Sugi sulla zona, facendo attenzione a non insultare il midollo spinale. Inoltre, creare una barriera attorno al perimetro della finestra posizionando un piccolo pezzo di cotone assorbibile nelle parti laterali della finestra spinale per prevenire l'occlusione del sito di iniezione da sanguinamento continuo o perdite di liquido cerebrospinale. Per le iniezioni dirette nel midollo spinale, utilizzare la punta dell'ago di iniezione di vetro per approssimare la linea mediana del midollo spinale identificando l'arteria spinale.
Quindi, posizionare l'ago appena posteriormente alla lamina C5 sulla linea mediana approssimativa e utilizzarlo come punto di riferimento. Quindi, utilizzando il micro manipolatore, spostare l'ago lateralmente verso destra di 0,3 millimetri e abbassare l'ago fino a toccare la superficie del midollo spinale. Da questa profondità, immergere l'ago.
0,6 millimetri nel midollo spinale. Iniettare un microlitro del virus retro adeno-associato due portatori del gene Cre ricombinasi a 250 nanolitri al minuto. Quindi attendere due minuti affinché il virus si diffonda nel midollo spinale prima di ritirare lentamente l'ago.
La marcatura dei neuroni del tratto corticospinale di livello cinque nella corteccia motoria di una sezione coronale cerebrale che esprime i DREADD Cre-dipendenti mCherry co-iniettati con un'iniezione controlaterale della colonna vertebrale di retro Cre è mostrata qui. Essere in grado di indirizzare specifiche popolazioni neuronali aiuterà a delineare le sfumature che guidano il recupero e fornirà una maggiore precisione per il trattamento della lesione del midollo spinale sottostante nel sistema nervoso in via di sviluppo. Questo metodo ci ha spianato la strada per studiare la fattibilità dell'uso di DREADD eccitatori come mezzo per il trattamento delle lesioni del midollo spinale nei ratti giovani.
