Este es el primer protocolo que demuestra la coinfección exitosa del tracto corticoespinal en ratas neonatas. Proporciona un plan preciso para investigar cómo las subpoblaciones individuales de células en mamíferos jóvenes contribuyen a la recuperación de la lesión de la médula espinal. Al igual que otras técnicas de vector viral doble, este método permite al usuario transducir con precisión subpoblaciones específicas de neuronas, a su vez, lo que permite a los investigadores identificar la efectividad de varias técnicas quimiogenéticas para promover la recuperación.
Esperaríamos que los investigadores que no están familiarizados con esta técnica tengan dificultades para localizar la anatomía espinal adecuada. Por lo tanto, le recomendamos que cuente continuamente los segmentos vertebrales a menudo y siempre consulte sus puntos de referencia. Después de confirmar la profundidad de la anestesia en un cachorro neonatal de Sprague Dawley, identifique el área donde se realizará la incisión presionando los fórceps en la línea media en la parte superior del cuero cabelludo, sintiendo la sutura sagital.
Manteniendo la piel tensa para asegurar una incisión limpia, recta y precisa, haga una incisión de un centímetro a lo largo del plano de sutura sagital comenzando inmediatamente por encima de la línea I. A continuación, identifique el bregma sondeando suavemente los fórceps a lo largo de la superficie del cráneo, prestando mucha atención a las líneas de sutura y una hendidura causada por los fórceps que corren a lo largo de los huesos parietal y frontal. Mantenga la abertura aplicando ganchos pesados en el lado de interés.
Elimine la aponeurosis usando una combinación de puntas de algodón y micro tijeras para maximizar la exposición del bregma para una mayor precisión. Asegúrese de que la sutura coronal esté a la vista lo suficientemente lejos lateralmente para proporcionar una plantilla aproximada para inyecciones posteriores. Usando las microtijeras, corte una sección de aproximadamente tres por dos milímetros del hueso frontal izquierdo del cráneo inmediatamente adyacente al bregma.
Limpie cualquier residuo, líquido cefalorraquídeo y sangre con puntas de algodón. Para inyectar el virus, coloque la aguja en su lugar y programe el inyector para inyectar un microlitro a una velocidad de 250 nanolitros por minuto. Al finalizar la inyección, deje que la aguja descanse en la corteza durante tres minutos.
Repita las inyecciones en las otras coordenadas para un total de tres inyecciones a lo largo de la corteza en relación con el bregma, todas a una profundidad de 0,6 milímetros. Después de completar las inyecciones, suture el cuero cabelludo y transfiera al animal a la otra mesa de operaciones para la laminectomía cervical. Palpar la base del cráneo con los dedos para identificar el sitio de la incisión.
Mantenga la piel tensa aplicando tensión con el pulgar y el índice. Usando una cuchilla número 11, comience la incisión en la línea media de uno a dos milímetros posterior a la base del cráneo y extienda la incisión un centímetro posterior para exponer el músculo superficial. Usando la punta afilada de la cuchilla, haga suavemente una serie de cortes a lo largo de la línea media del músculo superficial para exponer la cavidad espinal y los músculos espinales profundos.
Luego use un par de fórceps para abrir el músculo y visualizar la ventana quirúrgica. Una vez que los músculos espinales profundos han sido expuestos, inserte retractores en la ventana quirúrgica y retraiga la ventana quirúrgica a siete a ocho milímetros de ancho, permitiendo una vista sin obstrucciones de la columna vertebral. Identificar la segunda vértebra cervical por su prominente proceso espinoso que se proyecta dorsalmente y encapsula un gran músculo en forma de cúpula.
Usando el borde plano de un raspador de hueso, raspe suavemente el músculo espinal profundo a los lados para exponer las vértebras C3 a C7. Comience medial y raspe lateralmente a lo largo de la dirección paralela a las láminas vertebrales para garantizar una exposición adecuada, lo que permite una clara distinción de las láminas vertebrales. Controle cualquier sangrado con puntas de algodón.
Usando C2 como guía al contar los niveles vertebrales, corte cuidadosamente los bordes laterales de las láminas cartilaginosas en C6 y C7 usando un par de microtijeras. Usando un par de pinzas finas, retire cuidadosamente la porción diseccionada de la lámina para exponer la médula espinal, asegurándose de que la ventana espinal sea lo suficientemente grande como para acomodar el sitio de inyección deseado. Coloque al animal en el soporte craneal estereotáxico y coloque un trozo de gasa enrollado debajo del tronco del animal para elevar sus cuartos traseros.
Antes de comenzar las inyecciones, limpie la ventana espinal de cualquier sangre o líquido cefalorraquídeo aplicando suavemente puntas de algodón y triángulos Sugi en el área, teniendo cuidado de no insultar la médula espinal. Además, cree una barrera alrededor del perímetro de la ventana colocando un pequeño trozo de algodón absorbible en las partes laterales de la ventana espinal para evitar la oclusión del sitio de inyección por sangrado continuo o fuga de LCR. Para inyecciones directas en la médula espinal, use la punta de la aguja de inyección de vidrio para aproximar la línea media de la médula espinal identificando la arteria espinal.
A continuación, coloque la aguja justo después de la lámina C5 en la línea media aproximada y utilícela como punto de referencia. Luego, usando el micromanipulador, mueva la aguja lateralmente hacia la derecha en 0,3 milímetros y baje la aguja hasta que solo toque la superficie de la médula espinal. Desde esta profundidad, sumerge la aguja.
0,6 milímetros en la médula espinal. Inyecte un microlitro del virus retro adenoasociado dos portador del gen de la recombinasa Cre a 250 nanolitros por minuto. Luego espere dos minutos para que el virus se difunda en la médula espinal antes de retirar lentamente la aguja.
Aquí se muestra el etiquetado de las neuronas del tracto corticoespinal de la capa cinco en la corteza motora de una sección coronal cerebral que expresa DREADDs dependientes de Cre mCherry coinyectado con una inyección contralateral en la columna vertebral de Cre retro. Ser capaz de dirigirse a poblaciones neuronales específicas ayudará a delinear los matices que impulsan la recuperación y proporcionará más precisión para tratar la lesión subyacente de la médula espinal en el sistema nervioso en desarrollo. Este método allanó el camino para que investiguemos la viabilidad del uso de DREADDs excitatorios como un medio para tratar la lesión de la médula espinal en ratas jóvenes.
