これは、新生児ラットにおける皮質脊髄路の共感染の成功を実証する最初のプロトコルです。これは、若い哺乳類の細胞の個々の亜集団が脊髄損傷からの回復にどのように寄与するかを調査するための正確な青写真を提供します。他のダブルウイルスベクター技術と同様に、この方法は、ユーザーがニューロンの特定の亜集団を正確に形質転換することを可能にし、次に、研究者が回復を促進する上での様々な化学遺伝学的技術の有効性を特定することを可能にする。
この技術に慣れていない研究者は、適切な脊椎解剖学的構造を見つけるのに苦労すると予想されます。そのため、椎骨セグメントを頻繁にカウントし続け、常にランドマークを参照することをお勧めします。新生児Sprague Dawleyの子犬の麻酔の深さを確認した後、頭皮上部の正中線の鉗子を押して切開を行う領域を特定し、矢状縫合糸を感じます。
皮膚をぴんと張って、清潔でまっすぐで正確な切開を確実にするために、Iラインのすぐ上から始まる矢状縫合面に沿って1センチメートルの切開を行います。次に、頭蓋骨の表面に沿って鉗子をそっと調べ、縫合線と頭頂骨と前頭骨に沿って走る鉗子によって引き起こされるくぼみに細心の注意を払って、ブレグマを特定します。関心のある側面に加重フックを適用して開口部を維持します。
綿の先端とマイクロハサミの組み合わせを使用して腱膜を取り除き、ブレグマの露出を最大化して精度を高めます。冠状縫合糸が、その後の注射のための大まかなテンプレートを提供するのに十分なほど横方向にはっきりと見えることを確認してください。マイクロハサミを使用して、ブレグマのすぐ隣にある左前頭蓋骨の約3 x 2ミリメートルの部分を切り取ります。
綿の先端で破片、脳脊髄液、血液を取り除きます。ウイルスを注入するには、針を所定の位置に置き、毎分250ナノリットルの速度で1マイクロリットルを注入するようにインジェクターをプログラムします。注射が完了したら、針を皮質に3分間置きます。
他の座標で注射を繰り返し、ブレグマに対して皮質に沿って合計3回の注射を行い、すべて0.6ミリメートルの深さで行います。注射が完了したら、頭皮を縫合し、子宮頸椎弓切除術のために動物を他の手術台に移します。指を使って頭蓋骨の付け根を触診し、切開部位を特定します。
親指と人差し指で張力を加えて、皮膚を緊張させます。11番の刃を使用して、頭蓋底の1〜2ミリメートル後方の正中線から切開を開始し、切開を1センチメートル後方に伸ばして表在筋を露出させます。刃の鋭い先端を使用して、表在筋の正中線に沿って一連の切り込みを静かに行い、脊髄腔と深部脊髄筋を露出させます。
次に、鉗子を使用して筋肉を広げ、手術ウィンドウを視覚化します。脊髄深部の筋肉が露出したら、開創器を手術窓に挿入し、手術窓の幅を7〜8ミリメートルに引っ込めて、脊椎の遮るもののない視界を可能にします。2番目の頸椎は、背側に突出し、大きなドーム型の筋肉をカプセル化する顕著な棘突起によって識別されます。
骨スクレーパーの平らなエッジを使用して、深部の脊髄筋を側面までそっとこすり落とし、C3からC7の椎骨を露出させます。内側から始めて、椎椎板に平行な方向に沿って横方向にこすり、適切な露出を確保し、椎弓板を明確に区別できるようにします。綿の先端で出血を抑えます。
椎骨レベルをカウントするときにC2をガイドとして使用して、マイクロハサミを使用してC6とC7で軟骨薄板の側縁を慎重に切ります。一対の細かい鉗子を使用して、椎弓板の解剖部分を慎重に取り除き、脊髄を露出させ、脊髄窓が所望の注射部位を収容するのに十分な大きさであることを確認します。動物を定位固定装置の頭蓋ホルダーに置き、丸めたガーゼを動物の胴体の下に置き、後肢を持ち上げます。
注射を開始する前に、脊髄を侮辱しないように注意しながら、綿の先端とスギの三角形をその領域にそっと適用することにより、血液または脳脊髄液の脊髄窓を取り除きます。さらに、脊髄窓の外側部分に吸収性綿の小片を配置して窓の周囲にバリアを作成し、連続的な出血またはCSF漏出による注射部位の閉塞を防止する。脊髄への直接注射の場合は、ガラス注射針の先端を使用して、脊髄動脈を特定することにより、脊髄の正中線を近似します。
次に、針をC5椎弓板のすぐ後方のほぼ正中線に置き、これを基準点として使用します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、針を横方向に右に0.3ミリメートル動かし、脊髄の表面に触れるまで針を下げます。この深さから、針を突っ込みます。
脊髄に0.6ミリメートル。Creリコンビナーゼ遺伝子を担持する1マイクロリットルのレトロアデノ随伴ウイルス2個を毎分250ナノリットルで注入する。次に、ウイルスが脊髄に拡散するのを2分間待ってから、針をゆっくりと引き抜きます。
Cre依存性DREADDs mCherryを発現する脳冠状切片の運動皮質第5層皮質脊髄路ニューロンの標識を、レトロCreの対側脊椎注射と同時注射してここに示す。特定のニューロン集団を標的にできることは、回復を促進するニュアンスを描写し、発達中の神経系の根底にある脊髄損傷を治療するためのより正確なものを提供するのに役立ちます。この方法は、幼若ラットの脊髄損傷を治療する手段として興奮性DREADDを使用することの実行可能性を調査するための道を開いた。
