Il s’agit du premier protocole démontrant la co-infection réussie du tractus corticospinal chez les rats nouveau-nés. Il fournit un plan précis pour étudier comment les sous-populations individuelles de cellules chez les jeunes mammifères contribuent au rétablissement après une lésion de la moelle épinière. Comme d’autres techniques à double vecteur viral, cette méthode permet à l’utilisateur de transduire avec précision des sous-populations spécifiques de neurones, ce qui permet aux chercheurs d’identifier l’efficacité de diverses techniques chimiogénétiques pour favoriser le rétablissement.
Nous nous attendrions à ce que les chercheurs qui ne sont pas familiers avec cette technique aient du mal à localiser l’anatomie de la colonne vertébrale appropriée. Nous vous encourageons donc à compter continuellement les segments vertébraux souvent et à toujours vous référer à vos points de repère. Après avoir confirmé la profondeur de l’anesthésie chez un chiot néonatal Sprague Dawley, identifiez la zone où l’incision sera faite en appuyant sur la pince dans la ligne médiane sur le dessus du cuir chevelu, en sentant la suture sagittale.
En maintenant la peau tendue pour assurer une incision propre, droite et précise, faites une incision d’un centimètre le long du plan de suture sagittale en commençant immédiatement au-dessus de la ligne I. Ensuite, identifiez le bregma en sondant doucement les pinces le long de la surface du crâne, en portant une attention particulière aux lignes de suture et à une indentation causée par les pinces qui longent les os pariétaux et frontaux. Maintenez l’ouverture en appliquant des crochets lestés du côté de l’intérêt.
Effacer l’aponévrose à l’aide d’une combinaison de pointes de coton et de micro-ciseaux pour maximiser l’exposition du bregma pour une précision accrue. Assurez-vous que la suture coronale est bien visible suffisamment latéralement pour fournir un gabarit approximatif pour les injections ultérieures. À l’aide des micro-ciseaux, découpez une section d’environ trois millimètres sur deux de l’os frontal gauche du crâne immédiatement adjacent au bregma.
Enlevez tous les débris, le liquide céphalorachidien et le sang avec des pointes de coton. Pour injecter le virus, placez l’aiguille en place et programmez l’injecteur pour injecter un microlitre à un taux de 250 nanolitres par minute. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille reposer dans le cortex pendant trois minutes.
Répétez les injections aux autres coordonnées pour un total de trois injections le long du cortex par rapport au bregma, le tout à une profondeur de 0,6 millimètres. Après avoir terminé les injections, suturez le cuir chevelu et transférez l’animal sur l’autre table d’opération pour une laminectomie cervicale. Palper la base du crâne en utilisant les doigts pour identifier le site d’incision.
Maintenez la peau tendue en appliquant une tension avec le pouce et l’index. À l’aide d’une lame numéro 11, commencez l’incision à la ligne médiane d’un à deux millimètres postérieure à la base du crâne et étendez l’incision d’un centimètre à l’arrière pour exposer le muscle superficiel. En utilisant la pointe tranchante de la lame, faites doucement une série de coupures le long de la ligne médiane du muscle superficiel pour exposer la cavité vertébrale et les muscles profonds de la colonne vertébrale.
Ensuite, utilisez une paire de forceps pour ouvrir le muscle et visualiser la fenêtre chirurgicale. Une fois que les muscles profonds de la colonne vertébrale ont été exposés, insérez des rétracteurs dans la fenêtre chirurgicale et rétractez la fenêtre chirurgicale à sept à huit millimètres de largeur, permettant une vue dégagée de la colonne vertébrale. Identifiez la deuxième vertèbre cervicale par son apophyse épineuse proéminente qui se projette dorsalement et encapsule un gros muscle en forme de dôme.
À l’aide du bord plat d’un grattoir osseux, grattez doucement le muscle rachidien profond sur les côtés pour exposer les vertèbres C3 à C7. Commencez médialement et raclez latéralement le long de la direction parallèle aux lames vertébrales pour assurer une exposition appropriée, permettant une distinction claire des lames vertébrales. Contrôlez tout saignement avec des pointes de coton.
En utilisant C2 comme guide lors du comptage des niveaux vertébraux, coupez soigneusement les bords latéraux des lames cartilagineuses à C6 et C7 à l’aide d’une paire de micro-ciseaux. À l’aide d’une paire de pinces fines, retirez soigneusement la partie disséquée de la lame pour exposer la moelle épinière, en veillant à ce que la fenêtre vertébrale soit suffisamment grande pour accueillir le site d’injection souhaité. Installez l’animal dans le support crânien stéréotaxique et placez un morceau de gaze enroulé sous le tronc de l’animal pour élever ses quartiers postérieurs.
Avant de commencer les injections, nettoyez la fenêtre vertébrale de tout sang ou liquide céphalorachidien en appliquant doucement des pointes de coton et des triangles Sugi sur la zone, en prenant soin de ne pas insulter la moelle épinière. De plus, créez une barrière autour du périmètre de la fenêtre en plaçant un petit morceau de coton résorbable dans les parties latérales de la fenêtre vertébrale pour éviter l’occlusion du site d’injection par saignement continu ou fuite de LCR. Pour les injections directes dans la moelle épinière, utilisez la pointe de l’aiguille d’injection en verre pour approximer la ligne médiane de la moelle épinière en identifiant l’artère rachidienne.
Ensuite, placez l’aiguille juste en arrière de la lame C5 à la ligne médiane approximative et utilisez-la comme point de référence. Ensuite, à l’aide du micromanipulateur, déplacez l’aiguille latéralement vers la droite de 0,3 millimètre et abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche la surface de la moelle épinière. De cette profondeur, plongez l’aiguille.
0,6 millimètres dans la moelle épinière. Injecter un microlitre du virus adéno-associé rétro deux portant le gène Cre recombinase à 250 nanolitres par minute. Attendez ensuite deux minutes que le virus se diffuse dans la moelle épinière avant de retirer lentement l’aiguille.
Le marquage des neurones corticospinaux de couche cinq dans le cortex moteur d’une section coronale cérébrale exprimant Cre-dependent DREADDs mCherry co-injecté avec une injection controlatérale de rétro Cre est montré ici. Être capable de cibler des populations neuronales spécifiques aidera à délimiter les nuances conduisant à la récupération et fournira plus de précision pour traiter la lésion de la moelle épinière sous-jacente dans le système nerveux en développement. Cette méthode nous a ouvert la voie pour étudier la viabilité de l’utilisation de DREADDs excitateurs comme moyen de traiter les lésions de la moelle épinière chez les rats juvéniles.
