Bu, yenidoğan sıçanlarda kortikospinal sistemin başarılı bir şekilde birlikte enfeksiyonunu gösteren ilk protokoldür. Genç memelilerdeki hücrelerin bireysel alt popülasyonlarının omurilik yaralanmasından iyileşmeye nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için doğru bir plan sağlar. Diğer çift viral vektör teknikleri gibi, bu yöntem de kullanıcının nöronların spesifik alt popülasyonlarını doğru bir şekilde dönüştürmesine izin verir ve araştırmacıların iyileşmeyi teşvik etmede çeşitli kemogenetik tekniklerin etkinliğini belirlemelerine olanak tanır.
Bu tekniğe aşina olmayan araştırmacıların uygun omurga anatomisini bulmakta zorlanmalarını bekleriz. Bu nedenle, vertebral segmentleri sık sık saymanızı ve her zaman yer işaretlerinize geri dönmenizi öneririz. Yenidoğan bir Sprague Dawley yavrusunda anestezi derinliğini doğruladıktan sonra, kafa derisinin üstündeki orta çizgideki forsepslere basarak, sagital sütür için hissederek insizyonun yapılacağı alanı tanımlayın.
Temiz, düz ve hassas bir kesi sağlamak için cildi gergin tutarak, I çizgisinin hemen üstünden başlayarak sagital sütür düzlemi boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra, forsepsleri kafatasının yüzeyi boyunca nazikçe inceleyerek, dikiş çizgilerine ve parietal ve frontal kemikler boyunca uzanan forsepslerin neden olduğu bir girintiye dikkat ederek bregmayı tanımlayın. İlgilenilen tarafa ağırlıklı kancalar uygulayarak açıklığı koruyun.
Daha fazla doğruluk için bregmanın maruziyetini en üst düzeye çıkarmak için pamuk uçları ve mikro makasların bir kombinasyonunu kullanarak aponevrozu temizleyin. Koronal sütürün, sonraki enjeksiyonlar için kaba bir şablon sağlamak için yanal olarak yeterince net bir şekilde göründüğünden emin olun. Mikro makası kullanarak, bregmanın hemen bitişiğindeki sol frontal kafatası kemiğinin yaklaşık üç x iki milimetrelik bir bölümünü kesin.
Herhangi bir döküntüyü, beyin omurilik sıvısını ve kanı pamuk uçlarıyla temizleyin. Virüsü enjekte etmek için, iğneyi yerine yerleştirin ve enjektörü dakikada 250 nanolitre oranında bir mikrolitre enjekte edecek şekilde programlayın. Enjeksiyonun tamamlanmasının ardından, iğnenin kortekste üç dakika dinlenmesine izin verin.
Enjeksiyonları, bregma ile ilişkili olarak korteks boyunca toplam üç enjeksiyon için diğer koordinatlarda tekrarlayın, hepsi 0.6 milimetre derinlikte. Enjeksiyonları tamamladıktan sonra, kafa derisini dikin ve servikal laminektomi için hayvanı diğer ameliyat masasına aktarın. Kesi bölgesini tanımlamak için parmaklarınızı kullanarak kafatasının tabanını palpe edin.
Başparmak ve işaret parmağı ile gerginlik uygulayarak cildi gergin tutun. 11 numaralı bir bıçak kullanarak, kafatası tabanının bir ila iki milimetre gerisindeki orta çizgide insizyona başlayın ve yüzeysel kası ortaya çıkarmak için insizyonu bir santimetre posterior uzatın. Bıçağın keskin noktasını kullanarak, omurilik boşluğunu ve derin omurilik kaslarını açığa çıkarmak için yüzeysel kasın orta çizgisi boyunca yavaşça bir dizi kesik yapın.
Daha sonra kası açmak ve cerrahi pencereyi görselleştirmek için bir çift forseps kullanın. Derin omurga kasları açığa çıktıktan sonra, cerrahi pencereye retraktörler yerleştirin ve cerrahi pencereyi yedi ila sekiz milimetre genişliğe geri çekerek omurganın engelsiz bir görünümünü sağlayın. İkinci servikal omurları, dorsal olarak yansıyan ve büyük bir kubbe şeklindeki kası kapsülleyen belirgin dikenli süreci ile tanımlayın.
Bir kemik kazıyıcının düz kenarını kullanarak, C3'ü C7 omurlarına maruz bırakmak için derin omurilik kasını yanlara yavaşça kazıyın. Medial başlayın ve vertebral laminaların net bir şekilde ayırt edilmesini sağlamak için vertebra laminalarına paralel yönde lateral olarak kazıyın. Herhangi bir kanamayı pamuk uçlarıyla kontrol edin.
Vertebral seviyeleri sayarken C2'yi bir kılavuz olarak kullanarak, bir çift mikro makas kullanarak C6 ve C7'deki kıkırdaklı laminaların yanal kenarlarını dikkatlice kesin. Bir çift ince forseps kullanarak, omuriliği açığa çıkarmak için laminanın disseke edilmiş kısmını dikkatlice çıkarın ve spinal pencerenin istenen enjeksiyon bölgesini barındıracak kadar büyük olmasını sağlayın. Hayvanı stereotaksik kafatası tutucusuna yerleştirin ve arka çeyreklerini yükseltmek için hayvanın gövdesinin altına yuvarlanmış bir gazlı bez parçası yerleştirin.
Enjeksiyonlara başlamadan önce, omuriliğe hakaret etmemeye dikkat ederek, bölgeye pamuk uçları ve Sugi üçgenleri uygulayarak herhangi bir kan veya beyin omurilik sıvısının omurga penceresini temizleyin. Ayrıca, enjeksiyon bölgesinin sürekli kanama veya BOS sızıntısı ile tıkanmasını önlemek için omurga penceresinin yan kısımlarına küçük bir emilebilir pamuk parçası yerleştirerek pencerenin çevresi etrafında bir bariyer oluşturun. Omuriliğe doğrudan enjeksiyonlar için, omurilik arterini tanımlayarak omuriliğin orta hattına yaklaşmak için cam enjeksiyon iğnesinin ucunu kullanın.
Ardından, iğneyi yaklaşık orta çizgideki C5 laminanın hemen arkasına yerleştirin ve bunu referans noktası olarak kullanın. Daha sonra, mikro manipülatörü kullanarak, iğneyi yanal olarak sağa 0,3 milimetre hareket ettirin ve omuriliğin yüzeyine dokunana kadar iğneyi indirin. Bu derinlikten iğneyi batırın.
Omuriliğe 0,6 milimetre. Cre rekombinaz genini dakikada 250 nanolitrede taşıyan retro adeno ile ilişkili virüsün bir mikrolitresini enjekte edin. Ardından, iğneyi yavaşça geri çekmeden önce virüsün omuriliğe yayılması için iki dakika bekleyin.
Bir beyin koronal bölümünün motor korteksindeki beşinci katman kortikospinal sistem nöronlarının, retro Cre'nin kontralateral omurga enjeksiyonu ile birlikte enjekte edilen Cre'ye bağımlı DREADD'leri mCherry'yi eksprese eden etiketlemesi burada gösterilmiştir. Belirli nöronal popülasyonları hedefleyebilmek, iyileşmeyi yönlendiren nüansları tanımlamaya yardımcı olacak ve gelişmekte olan sinir sisteminde altta yatan omurilik yaralanmasının tedavisi için daha fazla doğruluk sağlayacaktır. Bu yöntem, uyarıcı DREADD'lerin genç sıçanlarda omurilik yaralanmasını tedavi etmek için bir araç olarak kullanılmasının uygulanabilirliğini araştırmamızın yolunu açtı.
