Это первый протокол, демонстрирующий успешную коинфекцию кортикоспинального тракта у неонатальных крыс. Он предоставляет точный план для изучения того, как отдельные субпопуляции клеток у молодых млекопитающих способствуют восстановлению после травмы спинного мозга. Как и другие методы двойного вирусного вектора, этот метод позволяет пользователю точно трансдуцировать специфические субпопуляции нейронов, в свою очередь, позволяя исследователям определить эффективность различных химиогенетических методов в содействии выздоровлению.
Мы ожидаем, что исследователи, которые не знакомы с этой техникой, будут бороться с поиском правильной анатомии позвоночника. И поэтому мы рекомендуем вам постоянно подсчитывать позвоночные сегменты часто и всегда возвращаться к вашим ориентирам. После подтверждения глубины анестезии у неонатального щенка Sprague Dawley определите область, где будет сделан разрез, надавливая щипцы в средней линии на верхней части кожи головы, ощупывая сагиттальный шов.
Удерживая кожу натянутой, чтобы обеспечить чистый, прямой и точный разрез, сделайте разрез в один сантиметр вдоль плоскости сагиттального шва, начиная непосредственно над линией I. Затем определите брегму, осторожно прощупав щипцы вдоль поверхности черепа, обращая пристальное внимание на линии шва и углубление, вызванное щипцами, идущими вдоль теменной и лобной костей. Поддерживайте отверстие, применяя утяжеленные крючки на интересующую сторону.
Очистите апоневроз, используя комбинацию ватных наконечников и микроножек, чтобы максимизировать экспозицию брегмы для повышения точности. Убедитесь, что корональный шов находится на видном месте достаточно далеко сбоку, чтобы обеспечить грубый шаблон для последующих инъекций. С помощью микроножек вырежьте примерно три на два миллиметра участок левой лобной кости черепа, непосредственно прилегающий к брегме.
Очистите любой мусор, спинномозговую жидкость и кровь с помощью ватных кончиков. Чтобы ввести вирус, поместите иглу на место и запрограммируйте инжектор на инъекцию одного микролитра со скоростью 250 нанолитров в минуту. По завершении инъекции дайте игле отдохнуть в коре в течение трех минут.
Повторите инъекции по другим координатам в общей сложности три инъекции вдоль коры по отношению к брегме, все на глубине 0,6 миллиметра. После завершения инъекций зашить кожу головы и перенести животное на другой операционный стол для шейной ламинэктомии. Пальпируйте основание черепа с помощью пальцев для идентификации места разреза.
Держите кожу подтянутой, применяя натяжение большим и указательным пальцами. Используя лезвие No 11, начните разрез по средней линии на один-два миллиметра кзади основания черепа и вытяните разрез на один сантиметр сзади, чтобы обнажить поверхностную мышцу. Используя острое острие лезвия, аккуратно сделайте серию разрезов вдоль средней линии поверхностной мышцы, чтобы обнажить спинномозговую полость и глубокие спинные мышцы.
Затем используйте пару щипцов, чтобы раздвинуть мышцу и визуализировать хирургическое окно. После того, как глубокие спинные мышцы были обнажены, вставьте ретракторы в хирургическое окно и втягивайте хирургическое окно до семи-восьми миллиметров в ширину, обеспечивая беспрепятственный обзор позвоночника. Определите второй шейный позвонок по его выдающемуся остистому отростку, который выступает дорсально и инкапсулирует большую куполообразную мышцу.
Используя плоский край костного скребка, аккуратно соскоблите глубокие спинномозговые мышцы в стороны, чтобы подвергнуть C3 позвонкам C7. Начинают медиально и соскребают латерально вдоль направления, параллельному пластинкам позвонка, чтобы обеспечить надлежащее воздействие, позволяя четко различать позвоночные пластинки. Контролируйте любое кровотечение с помощью хлопковых наконечников.
Используя С2 в качестве ориентира при подсчете уровней позвонков, аккуратно срежьте боковые края хрящевых пластинок при С6 и С7 с помощью микроножек. Используя пару тонких щипцов, осторожно удалите рассеченную часть пластинки, чтобы обнажить спинной мозг, гарантируя, что спинномозговое окно достаточно велико, чтобы вместить желаемое место инъекции. Поместите животное в стереотаксический краниальный держатель и поместите свернутый кусок марли под хобот животного, чтобы поднять его задние четверти.
Перед началом инъекций очистите спинномозговое окно от любой крови или спинномозговой жидкости, осторожно приложив ватные кончики и треугольники Суги к области, следя за тем, чтобы не оскорбить спинной мозг. Кроме того, создайте барьер по периметру окна, поместив небольшой кусочек рассасывающейся ваты в боковые части спинномозгового окна, чтобы предотвратить окклюзию места инъекции путем непрерывного кровотечения или утечки ликвора. Для прямых инъекций в спинной мозг используйте кончик стеклянной инъекционной иглы, чтобы приблизить среднюю линию спинного мозга, идентифицируя спинную артерию.
Затем поместите иглу чуть позади ламины С5 на приблизительной средней линии и используйте ее в качестве точки отсчета. Затем, используя микроманипулятор, переместите иглу сбоку вправо на 0,3 миллиметра и опустите иглу до тех пор, пока она просто не коснется поверхности спинного мозга. С этой глубины погрузите иглу.
0,6 миллиметра в спинной мозг. Введите один микролитр ретро-аденоассоциированного вируса, несущего ген Cre recombinase со скоростью 250 нанолитров в минуту. Затем подождите две минуты, пока вирус диффундирует в спинной мозг, прежде чем медленно выводить иглу.
Здесь показана маркировка пятого слоя нейронов кортикоспинального тракта в моторной коре коронального отдела мозга, экспрессирующих Cre-зависимые DREADDs mCherry, совместно вводимые с контралатеральной инъекцией ретро Cre в позвоночник. Возможность нацеливаться на конкретные нейронные популяции поможет очертить нюансы, способствующие восстановлению, и обеспечить большую точность лечения основной травмы спинного мозга в развивающейся нервной системе. Этот метод проложил нам путь к исследованию жизнеспособности использования возбуждающих DREADD в качестве средства для лечения травмы спинного мозга у ювенильных крыс.
