Este é o primeiro protocolo que demonstra a coinfecção bem-sucedida do trato corticoespinhal em ratos neonatais. Ele fornece um modelo preciso para investigar como subpopulações individuais de células em mamíferos jovens contribuem para a recuperação da lesão da medula espinhal. Como outras técnicas de vetor viral duplo, este método permite que o usuário transduzir com precisão subpopulações específicas de neurônios, por sua vez, permitindo que os pesquisadores identifiquem a eficácia de várias técnicas quimiogenéticas na promoção da recuperação.
Esperamos que os pesquisadores que não estão familiarizados com essa técnica lutem para localizar a anatomia espinhal adequada. E por isso encorajamos você a contar continuamente os segmentos vertebrais com frequência e sempre se referir aos seus pontos de referência. Após confirmar a profundidade da anestesia em um filhote de Sprague Dawley neonatal, identifique a área onde a incisão será feita pressionando a pinça na linha média na parte superior do couro cabeludo, sentindo a sutura sagital.
Segurando a pele esticada para garantir uma incisão limpa, reta e precisa, faça uma incisão de um centímetro ao longo do plano de sutura sagital começando imediatamente acima da linha I. Em seguida, identifique o bregma sondando suavemente o fórceps ao longo da superfície do crânio, prestando muita atenção às linhas de sutura e a um recuo causado pelo fórceps que corre ao longo dos ossos parietais e frontais. Mantenha a abertura aplicando ganchos ponderados no lado de interesse.
Limpe a aponeurose usando uma combinação de pontas de algodão e micro tesouras para maximizar a exposição do bregma para maior precisão. Certifique-se de que a sutura coronal esteja em visão clara o suficiente lateralmente para fornecer um modelo aproximado para injeções subsequentes. Usando a micro tesoura, corte uma seção de aproximadamente três por dois milímetros do osso do crânio frontal esquerdo imediatamente adjacente ao bregma.
Limpe quaisquer detritos, líquido cefalorraquidiano e sangue com pontas de algodão. Para injetar o vírus, coloque a agulha no lugar e programe o injetor para injetar um microlitro a uma taxa de 250 nanolitros por minuto. Após a conclusão da injeção, deixe a agulha descansar no córtex por três minutos.
Repita as injeções nas outras coordenadas para um total de três injeções ao longo do córtex em relação ao bregma, todas a uma profundidade de 0,6 milímetros. Depois de completar as injeções, suture o couro cabeludo e transfira o animal para a outra mesa de operação para laminectomia cervical. Apalpar a base do crânio usando os dedos para identificar o local da incisão.
Mantenha a pele tensa aplicando tensão com o polegar e o dedo indicador. Usando uma lâmina número 11, comece a incisão na linha média um a dois milímetros posterior à base do crânio e estenda a incisão um centímetro depois para expor o músculo superficial. Usando o ponto afiado da lâmina, faça suavemente uma série de cortes ao longo da linha média do músculo superficial para expor a cavidade espinhal e os músculos espinhais profundos.
Em seguida, use um par de pinças para abrir o músculo e visualizar a janela cirúrgica. Uma vez que os músculos espinhais profundos tenham sido expostos, insira afastadores na janela cirúrgica e retraia a janela cirúrgica para sete a oito milímetros de largura, permitindo uma visão desobstruída da coluna vertebral. Identifique a segunda vértebra cervical por seu proeminente processo espinhoso que se projeta dorsalmente e encapsula um grande músculo em forma de cúpula.
Usando a borda plana de um raspador de ossos, raspe suavemente o músculo espinhal profundo para os lados para expor as vértebras C3 a C7. Inicie a mediana e raspe lateralmente ao longo da direção paralela às lâminas das vértebras para garantir a exposição adequada, permitindo uma distinção clara das lâminas vertebrais. Controle qualquer sangramento com pontas de algodão.
Usando C2 como guia ao contar os níveis vertebrais, corte cuidadosamente as bordas laterais das lâminas cartilaginosas em C6 e C7 usando um par de micro tesouras. Usando um par de pinças finas, remova cuidadosamente a porção dissecada da lâmina para expor a medula espinhal, garantindo que a janela espinhal seja grande o suficiente para acomodar o local de injeção desejado. Coloque o animal no suporte craniano estereotáxico e coloque um pedaço enrolado de gaze sob o tronco do animal para elevar seus quartos traseiros.
Antes de iniciar as injeções, limpe a janela espinhal de qualquer sangue ou líquido cefalorraquidiano aplicando suavemente pontas de algodão e triângulos de Sugi na área, tomando cuidado para não insultar a medula espinhal. Além disso, crie uma barreira ao redor do perímetro da janela, colocando um pequeno pedaço de algodão absorvível nas porções laterais da janela espinhal para evitar a oclusão do local da injeção por sangramento contínuo ou vazamento de LCR. Para injeções diretas na medula espinhal, use a ponta da agulha de injeção de vidro para se aproximar da linha média da medula espinhal, identificando a artéria espinhal.
Em seguida, coloque a agulha logo posterior à lâmina C5 na linha média aproximada e use-a como ponto de referência. Em seguida, usando o micromanipulador, mova a agulha lateralmente para a direita em 0,3 milímetros e abaixe a agulha até que ela apenas toque a superfície da medula espinhal. A partir desta profundidade, mergulhe a agulha.
0,6 milímetros na medula espinhal. Injete um microlitro do vírus retro adenoassociado dois carregando o gene Cre recombinase a 250 nanolitros por minuto. Em seguida, aguarde dois minutos para que o vírus se difunda na medula espinhal antes de retirar lentamente a agulha.
A marcação de neurônios do trato corticoespinhal da camada cinco no córtex motor de uma seção coronal cerebral expressando DREADDs dependentes de Cre mCherry co-injetados com uma injeção contralateral de Cre retro na coluna vertebral é mostrada aqui. Ser capaz de atingir populações neuronais específicas ajudará a delinear as nuances que impulsionam a recuperação e fornecerá mais precisão para o tratamento da lesão subjacente da medula espinhal no sistema nervoso em desenvolvimento. Este método abriu o caminho para que pudéssemos investigar a viabilidade do uso de DREADDs excitatórios como um meio para o tratamento da lesão medular em ratos juvenis.
