从人骨关节炎膝关节收集和RNA提取

该协议鼓励使用原代人体组织作为骨关节炎研究的临床相关模型。在这些组织中进行基因表达和组织学分析可以提供新的机制见解。该技术标准化了识别和处理人类膝关节成分的方法。

它能够提取满足下游基因表达测定要求的高质量RNA。从患病的关节组织获得高质量的RNA具有挑战性，因此不应低估看似微不足道的步骤的重要性，例如保持一切清洁和凉爽。演示该程序的将是研究助理Thomas Wilson和我实验室的博士后研究员Navdeep Kaur。

首先根据大小、形状、颜色和质地的差异，从标本中识别硬组织，包括软骨、骨骼和半月板以及软组织，包括髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜和内侧蓬斜肌。将每个组织切成三个部分。用无菌PBS冲洗组织切片，以除去任何残留物或碎屑。

对于RNA提取，将三个组织切片中的每一个切成大约一到两毫米的立方体。将较小的碎片转移到两毫升冷冻小瓶中。紧紧固定盖子后，通过浸没在液氮中30秒来快速冷冻小瓶，然后将小瓶转移到零下80摄氏度的冰箱中进行长期储存，并对所有组织重复此过程。

使用研钵和研杵使硬组织均质化。在均质化之前，使用液氮冷却研钵，杵和刮刀，以防止样品解冻。一次只处理一个样品。

使用冷刮刀将组织样品转移到砂浆中。将液氮倒在组织顶部。液氮蒸发后，用研杵压碎组织。

在研磨组织的同时反复加入液氮，得到细小的组织粉。将细组织粉末转移到1.5毫升微量离心管中，通过浸没在液氮中预冷30秒。向每个管中加入一毫升冰冷的酸性胍苯酚溶液，并将管在冰上孵育20分钟。

在均质化不同的硬组织之前，用70%乙醇彻底清洁研钵，杵和刮刀，然后用RNase去污剂，然后用DEPC处理的水。将研钵，研杵和刮刀浸泡在70%乙醇中，然后用干净的无绒纸巾擦拭任何残留的液体。使用组织均质器使软组织均质化。

为了对均质器进行消毒，每次洗涤通过运行70%乙醇和RNase去污剂的管子洗涤探针30秒，然后用DEPC处理过的水洗涤，然后另外加70%乙醇，每次30秒。用干净、无绒毛的纸巾擦拭任何残留液体。将一毫升酸性胍苯酚溶液加入预先标记的五毫升圆底管中，并将组织样品转移到管中。

在整个过程中将管子放在冰上，并使组织匀浆最多五次32次脉冲，或直到组织在视觉上溶解。将均质组织孵育在冰上，直到所有组织样品都得到处理。在处理下一个组织样品之前，对均质器进行消毒和清洁。

使用无菌镊子，去除探针牙齿中存在的任何组织块。将所有均质组织在冰上再孵育20分钟，然后将组织样品转移到预先标记的，预冷的1.5毫升微量离心管中。从骨关节炎患者身上获得的七个独特的人类膝关节组织在手术切除后四小时内得到处理。

通过视觉鉴定组织并通过H&E组织学染色确认组织组织学。H&E染色的硬组织切片，关节软骨，软骨下骨和半月板以六倍放大倍率和40倍放大倍率可视化。同样，H&E染色的软组织切片，髌下脂肪垫，前交叉韧带，滑膜和内侧腹斜肌在六倍放大镜下可视化，然后在40倍放大镜下可视化。

提取的RNA的质量评估表明，基于完整性，产量和纯度的高质量样品以及低质量样品的存在，这表明尽管使用了优化的方法，但疾病严重程度等外部因素可能会影响同一患者不同组织的RNA质量。正确鉴定每种组织类型对于在患者样本内和患者样本之间进行组织内和组织间比较是必要的，特别是考虑到原发性疾病组织具有相当大的异质性。测序技术正在迅速发展，高质量RNA的分离是使用这些技术解开骨关节炎等复杂慢性疾病中潜在组织特异性机制的关键先决条件。