このプロトコルは、変形性関節症研究のための臨床的に関連するモデルとして、一次ヒト組織の使用を奨励する。これらの組織で遺伝子発現と組織学的解析を行うことは、新たな機械学的洞察を提供するかもしれない。この技術は、ヒト膝関節成分の同定と処理の方法を標準化する。
それは下流の遺伝子発現の調査のための条件を満たす高品質のRNAの抽出を可能にする。病気の関節組織から高品質のRNAを得ることは困難であるため、すべてを清潔で涼しく保つなど、一見重要でないステップの重要性を過小評価すべきではありません。この手順を実証するには、トーマス・ウィルソン研究員と私の研究室の博士研究員であるナブディープ・カウルです。
まず、軟骨、骨、半月板や軟部組織を含む硬い組織を同定することから始めます, 眼底脂肪パッドを含みます, 前十字靭帯, 滑膜と広大な内側筋肉は、サイズの違いに基づいて、標本から斜視.各組織を3つのセクションに切ります。滅菌PBSで組織切片をすすいで、残留物や破片を除去します。
RNA抽出では、3つの組織切片をそれぞれ約1~2ミリメートルの立方体に切り取ります。小さな部分を2ミリリットルのクライオバイアルに移します。キャップをしっかりと固定した後、フラッシュは30秒間液体窒素に沈めることによってバイアルを凍結し、その後、長期保存のためにマイナス80°Cの冷凍庫にバイアルを移し、すべての組織に対してこの手順を繰り返します。
モルタルと害虫を使用して硬質組織を均質化します。均質化する前に、液体窒素を使用してモルタル、害虫、へらを冷やし、サンプルが解凍されるのを防ぎます。一度に 1 つのサンプルのみを処理します。
冷やしたへらを使用して、組織サンプルをモルタルに移します。組織の上に液体窒素を注ぎます。液体窒素が蒸発した後、害虫で組織を粉砕します。
組織を粉砕しながら液体窒素を繰り返し加え、微細組織粉末を得る。液体窒素に30秒間浸して冷やした1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管で細かい組織粉末を移す。各チューブに氷冷酸グアニジニウムフェノール溶液を1ミリリットル加え、氷上でチューブを20分間インキュベートします。
異なる硬質組織を均質化する前に、70%エタノールでモルタル、害虫およびヘラを徹底的に洗浄し、次にRNaseデコンタミナントを使用し、続いてDEPC処理水を洗浄する。乳鉢、害虫、へらを70%エタノールに浸し、残りの液体を清潔で糸くない組織で拭きます。組織ホモジナイザーを使用して軟組織を均質化する。
ホモジナイザーを消毒する場合は、70%エタノールとRNaseデコンタミナントのチューブを1洗浄あたり30秒間実行してプローブを洗浄し、次にDEPC処理水で洗浄し、さらに70%エタノールを追加して30秒間洗浄します。清潔で糸くずのないティッシュで残った液体を拭きます。酸グアニジニウムフェノール溶液を1ミリリットルを事前標識した5ミリリットルの丸底チューブに加え、組織サンプルをチューブに移します。
管を氷の上に置き、最大5つの32番目のパルス、または組織が視覚的に溶解するまで組織を均質化します。すべての組織サンプルが処理されるまで、氷の上で均質化された組織をインキュベートします。次の組織サンプルを処理する前にホモジナイザーを消毒し、洗浄してください。
滅菌鉗子を使用して、プローブの歯に存在する組織チャンクを除去する。氷上のすべての均質化された組織をさらに20分間インキュベートし、組織サンプルを事前にラベル付けされた1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。変形性関節症患者から得られた7つのユニークなヒト膝関節組織は、外科的除去の4時間以内に処理された。
組織を視覚的に同定し、H&E組織学的染色によって確認した。H&E染色硬い組織切片、関節軟骨、軟骨下骨および半月板を6倍の倍率および40倍の倍率で視覚化した。同様に、H&E染色された軟部組織切片、眼底脂肪パッド、前十字靭帯、滑膜及び斜視の粘膜及び斜視の筋肉を6倍の倍率で可視化し、その後40倍の倍率で可視化した。
抽出されたRNAの品質評価は、完全性、収量および純度に基づく高品質サンプルの存在を示し、低品質のサンプルを最適化した方法を使用しているにもかかわらず、疾患の重症度などの外部要因が同じ患者の異なる組織全体のRNA品質に影響を与える可能性があることを示唆した。各組織タイプの正しい同定は、特に原発性疾患組織のかなりの不均一性を考えると、患者サンプル内および患者サンプル間の組織間比較を可能にするために必要である。シーケンシング技術は急速に進化しており、これらの技術を使用して変形性関節症のような複雑な慢性疾患の根底にある組織特異的メカニズムを解明するには、高品質のRNAの単離が不可欠です。
