يشجع هذا البروتوكول على استخدام الأنسجة البشرية الأولية كنموذج ذي صلة سريريا لأبحاث هشاشة العظام. قد يوفر إجراء التعبير الجيني والتحليلات النسيجية في هذه الأنسجة رؤى ميكانيكية جديدة. هذه التقنية توحيد أساليب لتحديد ومعالجة مكونات مفصل الركبة البشرية.
وهو يتيح استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة التي تلبي متطلبات المقايسات التعبير الجيني المصب. من الصعب الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من أنسجة المفاصل المريضة ، لذلك لا ينبغي التقليل من أهمية الخطوات التي تبدو تافهة ، مثل الحفاظ على كل شيء نظيف وبارد. إثبات الإجراء سيكون توماس ويلسون، باحث مشارك ونافيديب كاور، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري.
ابدأ بتحديد الأنسجة الصلبة ، بما في ذلك الغضاريف والعظام والغضروف المفصلي والأنسجة الرخوة ، بما في ذلك وسادة الدهون تحت الصوتية ، الرباط الصليبي الأمامي ، الزليلي والعضلات المائلة الشاسعة الوسطى من العينة استنادا إلى الاختلافات في الحجم والشكل واللون والملمس. قطع كل من الأنسجة إلى ثلاثة أقسام. شطف أقسام الأنسجة مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة أي بقايا أو حطام.
لاستخراج الحمض النووي الريبي، وقطع كل من أقسام الأنسجة الثلاثة إلى ما يقرب من مكعبات 1-2 ملليمتر. نقل القطع الصغيرة إلى قارورة بكريو ملليلتر اثنين. بعد تأمين القبعات بإحكام، فلاش تجميد قوارير عن طريق الغمر في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية، ثم نقل القارورة إلى الفريزر ناقص 80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل، وتكرار هذا الإجراء لجميع الأنسجة.
تجانس الأنسجة الصلبة باستخدام هاون والحشرات. قبل التجانس، قم بتبريد الهاون والحشرات والملعقة باستخدام النيتروجين السائل لمنع العينة من الذوبان. معالجة عينة واحدة فقط في كل مرة.
نقل عينة الأنسجة إلى هاون باستخدام ملعقة مبردة. صب النيتروجين السائل على رأس الأنسجة. بعد أن يتبخر النيتروجين السائل ، سحق الأنسجة مع الحشرات.
إضافة النيتروجين السائل مرارا وتكرارا في حين طحن الأنسجة للحصول على مسحوق الأنسجة الدقيقة. نقل مسحوق الأنسجة الدقيقة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الصغرى المبردة مسبقا عن طريق الغمر في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية. إضافة ملليلتر واحد من محلول جوانيدينيوم فينول حمض الجليد البارد إلى كل أنبوب واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
قبل تجانس الأنسجة الصلبة المختلفة ، قم بتنظيف هاون وحشرات وملعقة بدقة مع 70٪ من الإيثانول ، ثم مع إزالة التلوث من RNase ، تليها المياه المعالجة DEPC. نقع هاون، الحشرات وملعقة في الإيثانول 70٪، ثم مسح أي السائل المتبقية مع نظيفة، والأنسجة الخالية من الوبر. تجانس الأنسجة الرخوة باستخدام متجانس الأنسجة.
لتطهير المتجانس، اغسل المسبار عن طريق تشغيل أنابيب من الإيثانول 70٪ و RNase إزالة التلوث لمدة 30 ثانية لكل غسل، ثم يغسل مع المياه المعالجة DEPC، تليها إضافية 70٪ الإيثانول، كل لمدة 30 ثانية. مسح أي سائل المتبقية مع نظيفة، والأنسجة الخالية من الوبر. إضافة ملليلتر واحد من حمض guanidinium فينول حل لملصقة مسبقا، خمسة أنابيب القاع جولة ملليلتر، ونقل عينة الأنسجة في الأنبوب.
ضع الأنبوب على الجليد طوال العملية وتجانس الأنسجة لمدة أقصاها خمس نبضات 32 ، أو حتى يذوب النسيج بصريا. احتضان الأنسجة المتجانسة على الجليد حتى تتم معالجة جميع عينات الأنسجة. تطهير وتنظيف المتجانس قبل معالجة عينة الأنسجة التالية.
باستخدام ملقط معقم، قم بإزالة أي قطعة نسيج موجودة في أسنان المسبار. احتضان جميع الأنسجة المتجانسة على الجليد لمدة 20 دقيقة إضافية ومن ثم نقل عينة الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى مسبقا، المبردة مسبقا 1.5 ملليلتر. تمت معالجة سبعة أنسجة مفصل الركبة البشرية الفريدة التي تم الحصول عليها من مرضى هشاشة العظام في غضون أربع ساعات من الإزالة الجراحية.
تم التعرف على الأنسجة بصريا وأكدتها تلطيخ النسيج H &؛ E. تم تصور أقسام الأنسجة الصلبة الملطخة H &؛ E ، الغضاريف المفصلية ، العظام تحت الوخزات والغضروف المفصلي في ست مرات التكبير والتكبير 40 مرة. وبالمثل، تم تصور أقسام H &؛ E الأنسجة الرخوة الملون، وسادة الدهون infrapatellar، الرباط الصليبي الأمامي، الزليلي والعضلات المائلة vastus الوسطى في ست مرات التكبير ومن ثم في 40 مرة التكبير.
وأشار تقييم جودة الحمض النووي الريبي المستخرج إلى وجود عينات عالية الجودة على أساس السلامة والغلة والنقاء ، فضلا عن عينات منخفضة الجودة ، مما يشير إلى أنه على الرغم من استخدام طريقة محسنة ، فإن عوامل خارجية مثل شدة المرض قد تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي عبر أنسجة مختلفة من نفس المريض. ومن الضروري تحديد كل نوع من أنواع الأنسجة بشكل صحيح لتمكين المقارنات داخل الأنسجة وفيما بينها داخل عينات المرضى وعبرها، لا سيما بالنظر إلى عدم التجانس الكبير في أنسجة الأمراض الأولية. تتطور تقنيات التسلسل بسرعة ، وعزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة هو شرط أساسي حاسم لاستخدام هذه التقنيات لكشف الآليات الأساسية الخاصة بالأنسجة في الأمراض المعقدة والمزمنة مثل هشاشة العظام.
