פרוטוקול זה מעודד את השימוש ברקמות אנושיות ראשוניות כמודל רלוונטי קלינית לחקר דלקת מפרקים ניוונית. ביצוע ביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים ברקמות אלה עשוי לספק תובנות מכניות חדשניות. טכניקה זו לתקנן שיטות לזיהוי ועיבוד של רכיבי מפרק הברך האנושיים.
זה מאפשר הפקת RNA באיכות גבוהה העונה על הדרישות לבדיקות ביטוי גנים במורד הזרם. זה מאתגר להשיג RNA באיכות גבוהה מרקמות מפרקים חולים, ולכן אין לזלזל בחשיבות של צעדים חסרי משמעות לכאורה, כגון שמירה על הכל נקי וקריר. שידגים את ההליך יהיו תומאס וילסון, עמית מחקר ונבדיפ קור, פוסט דוקטורנט מהמעבדה שלי.
התחל בזיהוי הרקמות הקשות, כולל סחוס, עצם ומניסקוס ורקמות רכות, כולל כרית שומן אינפרא-פטלר, רצועה צולבת מקדימה, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis מהדגימה בהתבסס על ההבדלים בגודל, צורה, צבע ומרקם. חותכים כל אחת מהרקמות לשלושה חלקים. יש לשטוף את מקטעי הרקמות ב-PBS סטרילי כדי להסיר שאריות או פסולת.
להפקת RNA, חותכים כל אחד משלושת מקטעי הרקמה לקוביות מילימטר אחד עד שני מילימטר. מעבירים את החלקים הקטנים יותר ל-2 מיליליטר. לאחר אבטחת המכסים בחוזקה, פלאש להקפיא את הבקבוקונים על ידי שקוע בחנקן נוזלי במשך 30 שניות, ולאחר מכן להעביר את הבקבוקון למינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא לאחסון לטווח ארוך, ולחזור על הליך זה עבור כל הרקמות.
הומוגניזציה של הרקמה הקשה באמצעות מרגמה ועלי. לפני הומוגניזציה, לצנן את המרגמה, עלה ומרית באמצעות חנקן נוזלי כדי למנוע את המדגם מהפשרה. עבד רק מדגם אחד בכל פעם.
מעבירים את דגימת הרקמה למרגמה באמצעות מרית צוננת. יוצקים חנקן נוזלי על גבי הרקמה. לאחר החנקן הנוזלי מתאדה, למחוץ את הרקמה עם עלה.
מוסיפים שוב ושוב חנקן נוזלי תוך שחיקה של הרקמה כדי להשיג אבקת רקמות עדינה. מעבירים את אבקת הרקמה העדינה בצינור צנטריפוגה זעיר 1.5 מיליליטר מקורר מראש על ידי שקוע בחנקן נוזלי במשך 30 שניות. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת פנול חומצה קרה כקרח לכל צינור ודגרה הצינורות על קרח במשך 20 דקות.
לפני הומוגניזציה של רקמות קשות שונות, לנקות ביסודיות את המרגמה, העלי והמריבית עם 70%אתנול, ולאחר מכן עם מחטא RNase, ואחריו DEPC מטופלים מים. השרו את המרגמה, העלי והמרית ב-70%, ואז מחקו כל נוזל שיורית עם רקמה נקייה וניתנת מוך. הומוגניזציה הרקמה הרכה באמצעות הומוגניזר הרקמה.
לחיטוי homogenizer, לשטוף את הבדיקה על ידי צינורות פועלים של 70%אתנול ו RNase decontaminant במשך 30 שניות לכל לשטוף, ולאחר מכן לשטוף עם DEPC טיפול במים, ואחריו 70% אתנול נוסף, כל אחד במשך 30 שניות. יש לנגב כל שאריות נוזל עם רקמה נקייה וניתנת מוך. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת פנול חומצה guanidinium לתווית מראש, חמישה מיליליטר צינורות תחתון עגולים, ולהעביר את דגימת הרקמה לתוך הצינור.
מניחים את הצינור על קרח לאורך כל ההליך ומעבירים הומוגניות לרקמה למשך חמישה פולסים 32 לכל היותר, או עד שהרקמה מתמוססת חזותית. לדגור את הרקמה הומוגנית על קרח עד שכל דגימות הרקמה מעובדות. לחטא ולנקות את homogenizer לפני עיבוד דגימת הרקמה הבאה.
באמצעות מלקחיים סטריליים, להסיר כל גוש רקמה נוכח בשיני הבדיקה. לדגור את כל הרקמה הומוגנית על הקרח במשך 20 דקות נוספות ולאחר מכן להעביר את דגימת הרקמה לצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר שכותרתו מראש, מקורר מראש. שבע רקמות מפרקי ברך אנושיות ייחודיות שהתקבלו מחולי דלקת מפרקים ניוונית עובדו תוך ארבע שעות מהסרה כירורגית.
הרקמות זוהו חזותית ואושרו על ידי כתמים היסתולוגיים H&E. קטעי הרקמות הקשות המוכתמות ב- H&E, הסחוס המפרקי, העצם התת-לימודית והמניסקוס הוצגו בהגדלה כפולה ובהגדלה של פי 40. באופן דומה, קטעי רקמות רכות מוכתמים H&E, כרית שומן infrapatellar, רצועה צולבת חיצונית, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis היו דמיינו בהגדלה של פי שישה ולאחר מכן בהגדלה של פי 40.
הערכת האיכות של RNA שחולץ הצביעה על נוכחות של דגימות באיכות גבוהה המבוססות על שלמות, תשואה וטוהר, כמו גם דגימות באיכות נמוכה, מה שמרמז כי למרות שימוש בשיטה אופטימלית, גורמים חיצוניים כמו חומרת המחלה עשויים להשפיע על איכות ה- RNA על פני רקמות שונות מאותו חולה. זיהוי נכון של כל סוג רקמה יש צורך לאפשר השוואות פנים-רקמות בתוך ומרחב דגימות המטופל, במיוחד בהתחשב ההטרוגניות ניכרת של רקמות המחלה העיקרית. טכנולוגיות ריצוף מתפתחות במהירות, ובידוד של RNA באיכות גבוהה הוא תנאי מוקדם קריטי לשימוש בטכנולוגיות אלה כדי לפענח מנגנונים ספציפיים לרקמות במחלות מורכבות וכרוניות כמו דלקת מפרקים ניוונית.
