Bu protokol, osteoartrit araştırmaları için klinik olarak ilgili bir model olarak birincil insan dokularının kullanılmasını teşvik eder. Bu dokularda gen ekspresyolojisi ve histolojik analizler yapmak yeni mekanistik içgörüler sağlayabilir. Bu teknik, insan diz eklem bileşenlerinin tanımlanması ve işlenmesi için yöntemleri standartlaştırır.
Aşağı akış gen ekspresyoz tahlilleri için gereksinimleri karşılayan yüksek kaliteli RNA'nın çıkarılmasını sağlar. Hastalıklı eklem dokularından yüksek kaliteli RNA elde etmek zordur, bu nedenle her şeyi temiz ve serin tutmak gibi önemsiz görünen adımların önemi hafife alınmamalıdır. Prosedürü gösterenler thomas Wilson, araştırma görevlisi ve Navdeep Kaur, laboratuvarımdan doktora sonrası bir arkadaş.
Kıkırdak, kemik ve menisküs ve yumuşak dokular da dahil olmak üzere sert dokuları tanımlayarak başlayın, infrapateller yağ pedi, ön çapraz bağ, sinovyum ve vastus medialis eğik kas dahil olmak üzere örnekten boyut, şekil, renk ve doku farklılıklarına göre. Dokuların her birini üç bölüme bölün. Kalıntı veya döküntüleri gidermek için doku bölümlerini steril PBS ile durulayın.
RNA ekstraksiyonu için, üç doku bölümünün her birini yaklaşık bir ila iki milimetre küpler halinde kesin. Küçük parçaları iki mililitrelik kriyo şişesine aktarın. Kapakları sıkıca sabitledikten sonra, şişeleri sıvı nitrojene 30 saniye boyunca batırarak dondurun, ardından şişeyi uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarın ve tüm dokular için bu işlemi tekrarlayın.
Sert dokuyu bir harç ve pestle kullanarak homojenize edin. Homojenizasyondan önce, numunenin çözülmesini önlemek için sıvı azot kullanarak harç, pestle ve spatulayı soğutun. Aynı anda yalnızca bir örneği işleyin.
Doku örneğini soğutulmuş bir spatula kullanarak harçlara aktarın. Dokunun üzerine sıvı azot dökün. Sıvı nitrojen buharlaştıktan sonra, dokuyu bir haşere ile ezin.
İnce doku tozu elde etmek için dokuyu öğütürken tekrar tekrar sıvı azot ekleyin. İnce doku tozlarını 30 saniye boyunca sıvı nitrojene batırarak önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Her tüpe bir mililitre buz gibi asit guanidinium fenol çözeltisi ekleyin ve tüpleri 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
Farklı sert dokuyu homojenleştirmeden önce, harç, haşere ve spatulayı% 70 etanol, ardından RNaz dekontaminant ve ardından DEPC arıtılmış su ile iyice temizleyin. Harç, pestle ve spatulayı% 70 etanolde ıslatın, ardından kalan sıvıları temiz, tüy bırakmayan bir doku ile silin. Doku homojenizatör kullanarak yumuşak dokuyu homojenize edin.
Homojenizatörü dezenfekte etmek için, probu yıkama başına 30 saniye boyunca% 70 etanol ve RNaz dekontaminant tüpleri çalıştırarak yıkayın, ardından DEPC arıtılmış su ile yıkayın, ardından her biri 30 saniye boyunca ek% 70 etanol. Kalan sıvıları temiz, tüy bırakmayan bir dokuyla silin. Önceden etiketlenmiş, beş mililitre yuvarlak alt tüplere bir mililitre asit guanidinium fenol çözeltisi ekleyin ve doku örneğini tüpe aktarın.
Tüpü işlem boyunca buza yerleştirin ve en fazla beş 32. Homojenize dokuyu tüm doku örnekleri işlenene kadar buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Bir sonraki doku örneğini işlemeden önce homojenizatörleri dezenfekte edin ve temizleyin.
Steril kümesleri kullanarak, probun dişlerinde bulunan herhangi bir doku parçasını çıkarın. Buzdaki tüm homojenize dokuyu 20 dakika daha kuluçkaya yatırın ve ardından doku örneğini önceden etiketlenmiş, önceden soğutulmuş 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Osteoartrit hastalarından elde edilen yedi benzersiz insan diz eklem dokusu cerrahi olarak çıkarıldıktan sonraki dört saat içinde işlendi.
Dokular görsel olarak tanımlandı ve H&E histolojik lekeleme ile doğrulandı. H&E lekeli sert doku bölümleri, eklem kıkırdağı, subkondral kemik ve menisküs altı kat büyütme ve 40 kat büyütme ile görselleştirildi. Benzer şekilde, H&E lekeli yumuşak doku bölümleri, infrapateller yağ pedi, ön çapraz bağ, sinovyum ve vastus medialis eğik kas altı kat büyütme ve daha sonra 40 kat büyütme ile görselleştirildi.
Çıkarılan RNA'nın kalite değerlendirmesi, bütünlük, verim ve saflığa dayalı yüksek kaliteli örneklerin yanı sıra düşük kaliteli örneklerin varlığını belirterek, optimize edilmiş bir yöntem kullanılmasına rağmen, hastalık şiddeti gibi dış faktörlerin aynı hastadan farklı dokularda RNA kalitesini etkileyebileceğini düşündürmektedir. Her doku tipinin doğru tanımlanması, özellikle primer hastalık dokularının önemli heterojenliği göz önüne alındığında, hasta örnekleri içinde ve genelinde doku içi ve dokular arası karşılaştırmaları sağlamak için gereklidir. Sıralama teknolojileri hızla gelişmektedir ve yüksek kaliteli RNA izolasyonu, osteoartrit gibi karmaşık, kronik hastalıklarda dokuya özgü mekanizmaları çözmek için bu teknolojileri kullanmanın kritik bir ön koşuludur.
