Этот протокол поощряет использование первичных тканей человека в качестве клинически значимой модели для исследований остеоартрита. Выполнение экспрессии генов и гистологического анализа в этих тканях может обеспечить новые механистические идеи. Этот метод стандартизирует методы идентификации и обработки компонентов коленного сустава человека.
Это позволяет извлекать высококачественную РНК, которая соответствует требованиям к последующим анализам экспрессии генов. Получить высококачественную РНК из больных суставных тканей сложно, поэтому важность, казалось бы, незначительных шагов, таких как поддержание всего в чистоте и прохладе, не следует недооценивать. Продемонстрировать процедуру будут Томас Уилсон, научный сотрудник и Навдип Каур, постдокторант из моей лаборатории.
Начните с идентификации твердых тканей, включая хрящи, кости и мениски и мягкие ткани, включая инфрапателларную жировую прокладку, переднюю крестообразную связку, синовиальную и косую мышцу vastus medialis из образца на основе различий в размере, форме, цвете и текстуре. Разрежьте каждую из тканей на три части. Промойте участки тканей стерильным PBS, чтобы удалить остатки или мусор.
Для экстракции РНК разрежьте каждый из трех участков ткани примерно на один-два миллиметровых куба. Переложите более мелкие кусочки в двухмиллилитровой криобиржец. Плотно закрепив колпачки, во вспышке заморозьте флаконы, погружаясь в жидкий азот на 30 секунд, затем перенесите флакон в морозильную камеру при минус 80 градусах Цельсия для длительного хранения и повторите эту процедуру для всех тканей.
Гомогенизируйте твердую ткань с помощью ступки и пестиков. Перед гомогенизацией охладите ступку, пестик и шпатель, используя жидкий азот, чтобы предотвратить оттаивание образца. Обрабатывайте только один образец за раз.
Перенесите образец ткани в раствор с помощью охлажденного шпателя. Сверху на ткани вылейте жидкий азот. После того, как жидкий азот испарится, раздавите ткань пестиком.
Многократно добавляйте жидкий азот при измельчении ткани для получения мелкодисперсного порошка. Перенесите мелкодисперсный порошок в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, предварительно охлажденную погружающейся в жидкий азот на 30 секунд. Добавьте по одному миллилитру ледяного раствора гуанидиниумфенола в каждую трубку и инкубировать трубки на льду в течение 20 минут.
Перед гомогенизацией различных твердых тканей тщательно очистите раствор, пестик и шпатель 70% этанолом, затем обеззараживающим РНКазой, а затем водой, обработанной DEPC. Замочите ступку, пестик и лопатку в 70% этаноле, затем протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью. Гомогенизировать мягкие ткани с помощью тканевого гомогенизатора.
Для дезинфекции гомогенизатора промывайте зонд с помощью прогонов с 70% этанола и обеззараживающего РНКазы в течение 30 секунд на одну промывку, затем промывайте водой, обработанной DEPC, а затем дополнительно 70% этанолом, каждый в течение 30 секунд. Протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью. Добавьте один миллилитр раствора фенола кислоты гуанидиниума в предварительно маркированные пять миллилитровых пробирок с круглым дном и перенесите образец ткани в пробирку.
Поместите трубку на лед на протяжении всей процедуры и гомогенизируйте ткань максимум на пять 32-х импульсов или до тех пор, пока ткань визуально не растворится. Инкубировать гомогенизированную ткань на льду до тех пор, пока все образцы тканей не будут обработаны. Продезинфицируйте и очистите гомогенизатор перед обработкой следующего образца ткани.
Используя стерильные щипцы, удалите любой кусок ткани, присутствующий в зубах зонда. Инкубировать всю гомогенизированную ткань на льду в течение дополнительных 20 минут, а затем перенести образец ткани в предварительно маркированную, предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра. Семь уникальных тканей коленного сустава человека, полученных от пациентов с остеоартритом, были обработаны в течение четырех часов после хирургического удаления.
Ткани были идентифицированы визуально и подтверждены гистологическим окрашиванием H&E. Окрашенные H&E участки твердых тканей, суставной хрящ, субхондральная кость и мениск были визуализированы с шестикратным увеличением и 40-кратным увеличением. Аналогичным образом, окрашенные H&E участки мягких тканей, инфрапателлярная жировая прокладка, передняя крестообразная связка, синовиальная и косая мышца vastus medialis были визуализированы при шестикратном увеличении, а затем при 40-кратном увеличении.
Оценка качества экстрагированной РНК показала наличие образцов высокого качества, основанных на целостности, выходе и чистоте, а также образцов низкого качества, предполагая, что, несмотря на использование оптимизированного метода, внешние факторы, такие как тяжесть заболевания, могут влиять на качество РНК в разных тканях одного и того же пациента. Правильная идентификация каждого типа тканей необходима для обеспечения внутри- и межтканевых сравнений внутри и между образцами пациентов, особенно учитывая значительную гетерогенность тканей первичного заболевания. Технологии секвенирования быстро развиваются, и выделение высококачественной РНК является критически важной предпосылкой для использования этих технологий для разгадки основных тканеспецифических механизмов при сложных хронических заболеваниях, таких как остеоартрит.
