Este protocolo incentiva o uso de tecidos humanos primários como um modelo clinicamente relevante para a pesquisa da osteoartrite. A realização de expressões genéticas e análises histológicas nesses tecidos pode fornecer novos insights mecanicistas. Esta técnica padroniza métodos para identificação e processamento de componentes da articulação do joelho humano.
Permite a extração de RNA de alta qualidade que atenda aos requisitos para ensaios de expressão genética a jusante. É desafiador obter RNA de alta qualidade de tecidos articulares doentes, de modo que a importância de passos aparentemente insignificantes, como manter tudo limpo e frio não deve ser subestimado. Demonstrando o procedimento estarão Thomas Wilson, um pesquisador associado e Navdeep Kaur, um pós-doutorando do meu laboratório.
Comece pela identificação dos tecidos duros, incluindo cartilagem, osso e menisco e tecidos moles, incluindo almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, synovium e vasto músculo oblíquo do espécime com base nas diferenças de tamanho, forma, cor e textura. Corte cada um dos tecidos em três seções. Enxágüe as seções teciduais com PBS estéril para remover qualquer resíduo ou detrito.
Para extração de RNA, corte cada uma das três seções teciduais em cubos de aproximadamente um a dois milímetros. Transfira as peças menores para um frasco crioliter de dois mililitros. Depois de fixar as tampas firmemente, o flash congele os frascos submergindo em nitrogênio líquido por 30 segundos, em seguida, transfira o frasco para o congelador de menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo, e repita este procedimento para todos os tecidos.
Homogeneize o tecido duro usando uma argamassa e pilão. Antes da homogeneização, esfrie a argamassa, pilão e espátula usando nitrogênio líquido para evitar que a amostra descongele. Processe apenas uma amostra de cada vez.
Transfira a amostra de tecido para argamassa usando uma espátula gelada. Despeje nitrogênio líquido em cima do tecido. Depois que o nitrogênio líquido evaporar, esmague o tecido com um pilão.
Adicione repetidamente nitrogênio líquido enquanto moe o tecido para obter pó de tecido fino. Transfira o pó de tecido fino em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro pré-refrigerado submergindo em nitrogênio líquido por 30 segundos. Adicione um mililitro da solução de fenól de guanidinium ácido gelado a cada tubo e incubar os tubos no gelo por 20 minutos.
Antes de homogeneizar diferentes tecidos duros, limpe bem a argamassa, pilão e espátula com 70% de etanol, depois com descontaminante RNase, seguida pela água tratada da DEPC. Mergulhe a argamassa, pilão e espátula em 70% de etanol, depois limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e livre de fiapos. Homogeneize o tecido mole usando o homogeneizador de tecido.
Para desinfetar o homogeneizador, lave a sonda com tubos de 70% de etanol e RNase descontaminante por 30 segundos por lavagem, depois lave com água tratada DEPC, seguida de um adicional de 70% de etanol, cada um por 30 segundos. Limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e sem fiapos. Adicione um mililitro de solução de fenol de guanidinium ácido para tubos de fundo redondos pré-rotulados, cinco mililitros, e transfira a amostra de tecido para o tubo.
Coloque o tubo no gelo durante todo o procedimento e homogeneize o tecido por um máximo de cinco pulsos 32, ou até que o tecido sejalvido visualmente. Incubar o tecido homogeneizado no gelo até que todas as amostras de tecido sejam processadas. Desinfete e limpe o homogeneizador antes de processar a próxima amostra de tecido.
Usando fórceps estéreis, remova qualquer pedaço de tecido presente nos dentes da sonda. Incubar todo o tecido homogeneizado no gelo por mais 20 minutos e, em seguida, transferir a amostra de tecido para um tubo de micro centrífuga pré-rotulado, pré-refrigerado de 1,5 mililitro. Sete tecidos articulares humanos únicos obtidos de pacientes com osteoartrite foram processados dentro de quatro horas após a remoção cirúrgica.
Os tecidos foram identificados visualmente e confirmados pela coloração histológica da H&E. As seções de tecido duro manchados de H&E, cartilagem articular, osso subcondral e menisco foram visualizadas em seis vezes a ampliação e 40 vezes a ampliação. Da mesma forma, as seções de tecido mole manchado de H&E, almofada de gordura infrapaelar, ligamento cruzado anterior, sinovium e músculo oblíquo vasto medialis foram visualizados em seis vezes a ampliação e, em seguida, a 40 vezes a ampliação.
A avaliação da qualidade do RNA extraído indicou a presença de amostras de alta qualidade baseadas em integridade, rendimento e pureza, bem como amostras de baixa qualidade, sugerindo que, apesar do uso de um método otimizado, fatores externos como a gravidade da doença podem impactar a qualidade do RNA em diferentes tecidos do mesmo paciente. A identificação correta de cada tipo de tecido é necessária para permitir comparações intra e interseção de tecidos dentro e entre amostras de pacientes, especialmente dada a considerável heterogeneidade dos tecidos da doença primária. As tecnologias de sequenciamento estão evoluindo rapidamente, e o isolamento do RNA de alta qualidade é um pré-requisito crítico para o uso dessas tecnologias para desvendar mecanismos específicos do tecido subjacente em doenças crônicas complexas como a osteoartrite.
