Questo protocollo è significativo perché descrive in dettaglio come generare rapidamente grandi quantità di modello di DNA da utilizzare in reazioni prive di cellule da un piccolo frammento di gene ricevuto da una struttura di sintesi. L'amplificazione del cerchio rotante può generare grandi quantità di DNA più velocemente rispetto alla clonazione tradizionale. Quindi supporta cicli di apprendimento dei test di progettazione a throughput più elevato da librerie di DNA sintetico.
Queste tecniche possono avere una grande variabilità intrinseca per i nuovi utenti a causa dei molti passaggi e dei piccoli volumi richiesti. Un'attenta attenzione dovrebbe essere data alla tecnica e la pratica rende perfetti. Per iniziare, aggiungi tutti i componenti da un kit PCR in un singolo tubo PCR.
Quindi aggiungere un microlitro del frammento di gene risospeso. Omogeneizzare delicatamente la miscela ruotando su un'impostazione media per cinque-10 secondi. Dopo aver programmato il termociclatore secondo il protocollo del produttore del kit, eseguire la PCR.
Al termine della PCR, utilizzare un kit di pulizia PCR per purificare il DNA dalla miscela di reazione. In un tubo da 1,5 millilitri, aggiungere il tampone di legame del DNA e il campione PCR con un rapporto di cinque a uno. Trasferire questa miscela nella colonna di centrifuga e centrifugare a 16.000 volte G per un minuto.
Scartare il flusso attraverso. Aggiungere 200 microlitri del tampone di lavaggio del DNA alla colonna e incubarlo a temperatura ambiente per un minuto. Centrifugare nuovamente la colonna ed eliminare il flusso attraverso.
Lavare la colonna ancora una volta con il tampone di lavaggio del DNA, come dimostrato. Dopo aver eliminato il flusso dal secondo lavaggio, rimuovere l'eventuale tampone rimanente centrifugando la colonna per altri uno o due minuti. Per eluire il DNA, trasferire la colonna in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.
Quindi aggiungere 46 microlitri di acqua a doppio distillato nella colonna. Dopo un'incubazione di un minuto, raccogliere il DNA nel tubo mediante centrifugazione. E quantificare il DNA purificato usando uno spettrofotometro.
Per digerire e circolarizzare il DNA, combinare cinque microlitri del tampone di reazione necessario, 20 unità dell'enzima di restrizione HindIII e 45 microlitri del DNA purificato in un tubo PCR. Usando una pipetta, omogeneizzare delicatamente questa miscela. Quindi incubarlo in un termociclatore per 15 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, il calore inattiva l'enzima HindIII incubando per 20 minuti a 80 gradi Celsius. Quindi aggiungere cinque microlitri di T4 Ligase buffer e 800 unità di T4 Ligase al DNA appena digerito. Dopo aver mescolato delicatamente con una pipetta, incubare la miscela per un'ora a 25 gradi Celsius per eseguire la reazione di circolarizzazione.
Una volta completata la reazione, purificare il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR come dimostrato in precedenza. Quindi quantificare il DNA. Per eseguire l'amplificazione del cerchio di rotolamento, combinare tutti i componenti di reazione e un microlitro del modello di espressione circolare purificato in un unico tubo.
Omogeneizzare la miscela con una pipetta e aliquote 10 microlitri della miscela in quattro tubi separati. Incubare i tubi a 30 gradi Celsius per quattro-18 ore, quindi disattivare il calore dell'enzima incubando a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'inattivazione del calore, incoraggiare la condensa sul fondo del tubo incubando a 12 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, diluire la soluzione risultante aggiungendo 15 microlitri di acqua a doppio distillato a ciascun tubo. Combinare il contenuto di ciascun tubo prima di purificare e quantificare il DNA come dimostrato in precedenza. Per eseguire la reazione senza cellule, aggiungere i vari componenti necessari in un tubo e diluire al volume finale desiderato con acqua a doppio distillato.
Mescolare accuratamente la soluzione pipettando metà della soluzione su e giù da 10 a 20 volte. Trasferire la miscela di reazione in aliquote da 15 microlitri nei pozzetti desiderati nella piastra di microtitolazione. Quindi sigillare la piastra con un film sigillante incolore per mantenere l'umidità e prevenire l'evaporazione.
Posizionare la piastra sigillata nel lettore di piastre e consentire alla reazione di procedere al completamento. Se si esprime il gene BPN della subtilisina utilizzando il sistema privo di cellule, aliquote 94 microlitri di acqua a doppio distillato e un microlitro di 10 PNA micromolari in una piastra a fondo piatto e incolore da 96 pozzetti. Quindi aggiungere cinque microlitri della reazione senza cellule completata e leggere la piastra utilizzando un lettore di piastre impostato per misurare l'assorbanza a 410 nanometri ogni 20 secondi per 10 minuti mantenendo una temperatura di 25 gradi Celsius.
L'espressione della Superfolder GFP nell'estratto di stella BL21 DE3 utilizzando solo 3 microlitri di DNA RCA non purificato in una reazione a 15 microlitri è paragonabile a quella del plasmide PJL1. Raddoppiare e triplicare le quantità di template sembra non offrire alcun beneficio evidente, suggerendo livelli già saturi del template a 3 microlitri per reazione. Al contrario, sembra esserci un vantaggio nell'aumentare la quantità di modello RCA quando si utilizza l'estratto di cellule di deformazione shuffle.
Le proteine che richiedono temperature più basse o tempi di piegatura più lunghi influenzano il tempo necessario per completare l'intero flusso di lavoro. Ad esempio, l'analisi della subtilisina dopo quattro ore di espressione porta a un risultato fallito, poiché quattro ore non sono sufficienti per la maturazione della subtilisina. Tuttavia, consentire alla reazione di continuare a 16 ore porta a livelli rilevabili di subtilisina.
Tutti i componenti devono essere ben miscelati affinché questo protocollo funzioni alla massima efficienza. Seguendo questi metodi, una vasta libreria di proteine candidate può essere generata sinteticamente e quindi espressa a resa sufficiente per la caratterizzazione. Questo metodo ha spianato la strada al nostro gruppo per sviluppare N C due sensori che possono funzionare in estratti cellulari, permettendoci di caratterizzare rapidamente la proteina prototipo.
Questo ci consentirà di iterare in modo più rapido e intelligente la progettazione proteica di nuovi bio catalizzatori e terapie.
