פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא מפרט כיצד ליצור במהירות כמויות גדולות של תבנית DNA לשימוש בתגובות ללא תאים מרסיס גנים קטן שהתקבל ממתקן סינתזה. הגברה מעגלית מתגלגלת יכולה לייצר כמויות גדולות של דנ"א מהר יותר מאשר שיבוט מסורתי. אז זה תומך בעיצוב תפוקה גבוהה יותר לבנות מבחן ללמוד מחזורים מספריות של DNA סינתטי.
טכניקות אלה יכולות להיות שונות מובנית גדולה עבור משתמשים חדשים בשל השלבים הרבים ואמצעי האחסון הקטנים הנדרשים. יש לתשומת לב זהירה לטכניקה, והתרגול הופך למושלם. כדי להתחיל, הוסף את כל הרכיבים מערכת PCR בצינור PCR יחיד.
לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של שבר הגן המחודש. בעדינות הומוגניזציה התערובת על ידי מערבולת על הגדרה בינונית במשך חמש עד 10 שניות. לאחר תכנות התרמו-מחזור על פי פרוטוקול יצרן הערכה, הפעל את ה- PCR.
עם השלמת ה- PCR, השתמש בערכת ניקוי PCR כדי לטהר את ה- DNA מתערובת התגובה. בצינור 1.5 מיליליטר, להוסיף את מאגר כריכת DNA ואת דגימת PCR ביחס של חמש לאחד. מעבירים את התערובת הזו לעמודת הספין ולצנטריפוגה ב-16, 000 פעמים G למשך דקה אחת.
זרוק את הזרימה דרכה. הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת ה- DNA לעמוד ודגר אותו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. צנטריפוגה העמודה שוב ולבטל את הזרימה דרך.
לשטוף את העמודה פעם נוספת עם מאגר שטיפת DNA, כפי שהודגם. לאחר ביטול הזרימה דרך מהכביסה השנייה, הסר כל מאגר שנותר על-ידי צנטריפוגה של העמודה למשך 1 עד 2 דקות נוספות. כדי לחמוק מהדנ"א, העבר את הטור לצינור חדש של 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן להוסיף 46 microliters של מים מזוקקים כפולים לתוך העמודה. לאחר דגירה של דקה, לאסוף את ה- DNA לתוך הצינור על ידי צנטריפוגה. ולתייג את הדנ"א המטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
כדי לעכל ולהעקוף את הדנ"א, שלבו חמישה מיקרוליטרים של מאגר התגובה הדרוש, 20 יחידות של אנזים ההגבלה HindIII ו-45 מיקרוליטרים של הדנ"א המטוהר בצינור PCR. בעזרת פיפטה, בעדינות הומוגניזציה תערובת זו. ואז לדגור אותו תרמוציקל במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה הושלמה, חום להפעיל את האנזים HindIII על ידי דגירה במשך 20 דקות ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של חיץ T4 Ligase ו 800 יחידות של T4 Ligase לדנ"א שעוכל לאחרונה. לאחר ערבוב עדין עם פיפטה, לדגור על התערובת במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס כדי לבצע את תגובת המעגליזציה.
לאחר השלמת התגובה, טהרו את הדנ"א באמצעות ערכת ניקוי PCR כפי שהודגם בעבר. אז לכמת את הדנ"א. כדי לבצע את הגברת המעגל המתגלגל, שלבו את כל רכיבי התגובה ומיקרו-אליטר אחד של תבנית הביטוי המעגלית המטוהרת בצינור יחיד.
הומוגניזציה התערובת עם פיפטה aliquot 10 microliters של התערובת לארבעה צינורות נפרדים. לדגור את הצינורות ב 30 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 18 שעות, ולאחר מכן חום לאפעיל את האנזים על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר אי-הפעלה בחום, יש לעודד עיבוי בתחתית הצינור על ידי דגירה ב-12 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר מכן, לדלל את הפתרון המתקבל על ידי הוספת 15 microliters של מים מזוקקים כפולים לכל צינור. שלב את התוכן של כל צינור לפני טיהור וכימות ה- DNA כפי שהודגם בעבר. כדי לבצע את התגובה ללא תאים, מוסיפים את הרכיבים הנדרשים השונים לצינור ולדלל לנפח הרצוי הסופי עם מים מזוקקים כפולים.
מערבבים את הפתרון ביסודיות על ידי צנרת מחצית הפתרון למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים. מעבירים את תערובת התגובה ב-15 מיקרו-לייטר לבארות הרצויות בצלחת המיקרו-יטריטר. לאחר מכן לאטום את הצלחת עם סרט איטום חסר צבע כדי לשמור על לחות ולמנוע אידוי.
מניחים את הצלחת האטומה בקורא הלוחות ומאפשרים לתגובה להמשיך לסיום. אם מבטאים את הגן BPN subtilisin באמצעות מערכת ללא תאים, aliquot 94 microliters של מים מזוקקים כפולים מיקרוליטר אחד של 10 PNA מיקרומולר בצלחת שטוחה למטה, חסר צבע 96 באר. לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של התגובה ללא תאים הושלמה ולקרוא את הצלחת באמצעות קורא לוח להגדיר למדוד ספיגה ב 410 ננומטר כל 20 שניות במשך 10 דקות תוך שמירה על טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
ביטוי של GFP Superfolder בתמצית כוכב BL21 DE3 באמצעות רק 3 מיקרוליטרים של DNA RCA לא מpurified בתגובת 15 מיקרוליטר דומה לזה של PJL1 plasmid. הכפלה ושלשה של כמויות התבנית אינן מציעות תועלת ברורה, מה שמרמז על רמות רוויות כבר של התבנית ב-3 מיקרוליטרים לתגובה. לעומת זאת, נראה שיש יתרון להגדלת כמות תבנית RCA בעת שימוש בתמצית תא מאמץ דשדוש.
חלבונים הדורשים טמפרטורות נמוכות יותר או זמני קיפול ארוכים יותר משפיעים על הזמן הנדרש להשלמת זרימת העבודה כולה. לדוגמה, בדיקה subtilisin לאחר ארבע שעות של ביטוי מוביל לתוצאה כושלת, כמו ארבע שעות אינו מספיק עבור התבגרות subtilisin. עם זאת, מתן אפשרות לתגובה להמשיך 16 שעות מוביל לרמות הניתנות לזיהוי של subtilisin.
כל הרכיבים צריכים להיות מעורבים היטב כדי שפרוטוקול זה יפעל ביעילות מרבית. בעקבות שיטות אלה, ספרייה גדולה של מועמדים חלבון יכול להיווצר באופן סינתטי ולאחר מכן לידי ביטוי בתשואה מספקת לאפיון. שיטה זו סללה את הדרך עבור הקבוצה שלנו לפתח N C שני חיישנים שיכולים לעבוד בתמציות תאים, ומאפשר לנו לאפיין במהירות את חלבון אב הטיפוס.
זה יאפשר לנו לחזור במהירות ובתבונה על עיצוב חלבונים של זרזים ביולוגיים חדשים וטיפולים.
