使用无细胞系统快速表征遗传部分

我们的方法允许使用无细胞表达系统和PCR而不是克隆快速表征遗传部分。这种技术的主要优点是，使用这种方法可以在数小时到数天内完成通常需要数天到数周的细胞。我们的实验方案包括制作您自己的无细胞表达系统的步骤，这在许多地方可能很棘手，可能需要根据用例进行调整。

刚开始时，我们建议从商业套件开始。首先根据手稿中的说明制备PCR预混液并将其储存在冰上。将30或40微升预混液分装到确定数量的PCR管中，并向适当标记的PCR管中加入每5微摩尔可变引物10微升。

将PCR管放入热循环仪中，并按照文本手稿中所述运行PCR程序。然后，将反应保持在四摄氏度。如果原始模板是血浆DNA，则加入一微升DpnI限制性内切酶以消化原始模板，并在37摄氏度下孵育反应1小时。

通过使用 1% 琼脂糖凝胶在 180 伏下分离 20 分钟来分析每种 PCR 产物的 5 微升。检查正确的条带尺寸，该尺寸会随着所选的磁芯序列和添加部件的长度而变化。使用商业PCR纯化试剂盒纯化线性模板。

如果凝胶电泳存在多个条带，请按照制造商的说明从凝胶中切除感兴趣的条带并使用商业凝胶提取试剂盒纯化DNA。使用分光光度计量化每个DNA模板，通过检查260至280纳米的比例约为1.8来评估其质量。如手稿中所述，将所有组分在冰上解冻，并通过用移液管彻底混合所有组分来制备预混液。

注意避免沉淀，特别是氨基酸混合物。将预混液放在冰上。在冰上冷却 384 孔板，并将预混液以 9 微升等分试样分布到每个孔中。

将阻遏蛋白解冻在冰上并将其分配到声学液体处理源板中，确保包括所用源板类型所需的适当死体积。通过液体处理器将一微升体积的阻遏蛋白分配到适当的目标孔中。在平板上包括纯化报告基因的连续稀释液或适当的化学标准品，以将结果与其他研究和其他实验室进行比较。

在实验的预期表达范围内选择适合报告基因的浓度范围。将读板器预热至30摄氏度。如果可能，在仪器上设置一摄氏度的垂直温度梯度，以限制密封件上的冷凝。

将酶标仪设置为以适合核心序列中使用的报告器的设置读取，无需摇动步骤。用不透水的塑料密封密封384孔板以防止蒸发。将 384 孔板放在板架上并开始读取。

通过PCR制备了15个线性模板，仅在T7启动子相对于tetO序列的距离上变化，扩增超级文件夹绿色荧光蛋白报告基因，引物设计用于添加每个启动子变体。对整组T7 tetO组合的总共540个反应的数据的分析表明，T7 RNA聚合酶平均下调T7驱动的表达，从T7转录本开始到下游的13个碱基对。当将 5 微升转移分成单独的 1 微升分液时，使用声学液体处理器在一系列八个目标孔中观察到更一致的分配。

我们的协议可用于快速筛选遗传成分，无论是筛选新的生物传感器还是构建遗传部件的文库。