Этот протокол важен, потому что он подробно описывает, как быстро генерировать большое количество шаблона ДНК для использования в бесклеточных реакциях из небольшого фрагмента гена, полученного из установки синтеза. Амплификация по скользящему кругу может генерировать большое количество ДНК быстрее, чем традиционное клонирование. Таким образом, он поддерживает циклы обучения более высокой пропускной способности проектирования из библиотек синтетической ДНК.
Эти методы могут иметь большую вариативность для новых пользователей из-за множества шагов и небольших требуемых объемов. Внимательно следует уделить технике, а практика делает совершенным. Для начала добавьте все компоненты из набора ПЦР в одну ПЦР-трубку.
Затем добавьте один микролитр ресуспендированного фрагмента гена. Осторожно гомогенизируйте смесь путем вихря на среде в течение пяти-10 секунд. После программирования термоциклера в соответствии с протоколом производителя комплекта запустите ПЦР.
По завершении ПЦР используйте набор для очистки ПЦР для очистки ДНК от реакционной смеси. В пробирке объемом 1,5 миллилитра добавьте буфер связывания ДНК и образец ПЦР в соотношении пять к одному. Перенесите эту смесь в спиновую колонну и центрифугу при 16 000 G в течение одной минуты.
Отбросьте поток. Добавьте в колонку 200 микролитров буфера промывки ДНК и высиживайте его при комнатной температуре в течение одной минуты. Снова центрифугируйте колонну и отбросьте проточную.
Вымойте колонку еще раз с помощью буфера промывки ДНК, как показано на рисунке. После отбрасывания проточной части от второй промывки удалите оставшийся буфер, центрифугируя колонну в течение дополнительной одной-двух минут. Чтобы элюировать ДНК, перенесите колонку в новую 1,5-миллилитровую трубку.
Затем добавьте в колонку 46 микролитров двухдистиллированной воды. После минутной инкубации соберите ДНК в трубку путем центрифугирования. И количественно оценить очищенную ДНК с помощью спектрофотометра.
Чтобы переварить и циркуляризировать ДНК, объедините пять микролитров необходимого реакционного буфера, 20 единиц фермента рестрикции HindIII и 45 микролитров очищенной ДНК в трубке ПЦР. Используя пипетку, аккуратно гомогенизируйте эту смесь. Затем высиживают его в термоциклере в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
После того, как инкубация завершена, тепло инактивирует фермент HindIII путем инкубации в течение 20 минут при 80 градусах Цельсия. Затем добавьте пять микролитров буфера Т4-лигазы и 800 единиц Т4-лигазы к вновь переваренной ДНК. После осторожного смешивания с пипеткой инкубируйте смесь в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы выполнить реакцию циркуляризации.
Как только реакция будет завершена, очистите ДНК с помощью набора для очистки ПЦР, как показано ранее. Затем количественно оцените ДНК. Чтобы выполнить усиление круга прокатки, объедините все компоненты реакции и один микролитр очищенного циркулярного экспрессионного шаблона в одной трубке.
Гомогенизируйте смесь пипеткой и аликвотой 10 микролитров смеси в четыре отдельные пробирки. Инкубируйте трубки при температуре 30 градусов Цельсия в течение четырех-18 часов, затем нагревайте инактивировать фермент, инкубируя при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут. После инактивации тепла поощряйте конденсацию в нижней части трубки, насиживая при 12 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Далее разбавляют полученный раствор, добавляя в каждую трубку по 15 микролитров двойной дистиллированной воды. Объедините содержимое каждой трубки перед очисткой и количественной оценкой ДНК, как показано ранее. Чтобы выполнить бесклеточную реакцию, добавьте различные необходимые компоненты в трубку и разбавьте до конечного желаемого объема двойную дистиллированную воду.
Тщательно перемешайте раствор, пипетируя половину раствора вверх и вниз 10-20 раз. Перенесите реакционную смесь в 15-микролитровых аликвотах в нужные лунки в микротитровой пластине. Затем запечатайте пластину бесцветной уплотнительной пленкой для поддержания влажности и предотвращения испарения.
Поместите герметичную пластину в считыватель пластин и дайте реакции пройти до завершения. При экспрессии гена субтилизина BPN с использованием бесклеточной системы аликотируют 94 микролитра двойной дистиллированной воды и один микролитр 10 микромолярной ПНА в плоскодонной бесцветной 96-луночной пластине. Затем добавляют пять микролитров завершенной бесклеточной реакции и считывают пластину с помощью пластинчатого считывателя, установленного для измерения поглощения на 410 нанометров каждые 20 секунд в течение 10 минут при сохранении температуры 25 градусов Цельсия.
Экспрессия суперпапки GFP в экстракте звезды BL21 DE3 с использованием только 3 микролитров неочищенной ДНК RCA в 15-микролитровой реакции сопоставима с экспрессидой плазмиды PJL1. Удвоение и утроение количества шаблона, по-видимому, не дает очевидной выгоды, предполагая уже насыщенные уровни шаблона в 3 микролитра на реакцию. И наоборот, увеличение количества шаблона RCA при использовании экстракта клеток перетасовки штамма, по-видимому, имеет преимущество.
Белки, требующие более низких температур или более длительного времени складывания, влияют на время, необходимое для завершения всего рабочего процесса. Например, анализ субтилизина после четырех часов экспрессии приводит к неудачному результату, так как четырех часов недостаточно для созревания субтилизина. Однако, позволяя реакции продолжаться до 16 часов, приводит к обнаруживаемым уровням субтилизина.
Все компоненты должны быть хорошо перемешаны, чтобы этот протокол работал с максимальной эффективностью. Следуя этим методам, большая библиотека белковых кандидатов может быть сгенерирована синтетически, а затем выражена с достаточным выходом для характеристики. Этот метод проложил путь для нашей группы к разработке N C двух датчиков, которые могут работать в клеточных экстрактах, что позволяет нам быстро охарактеризовать прототип белка.
Это позволит нам быстрее и разумнее итерировать белковый дизайн новых биокатализаторов и методов лечения.
