Le cellule dendritiche, o DC, sono cellule immunitarie chiave che collegano il sistema immunitario innato e adattativo. Mentre le DC sono eterogenee, questo metodo ci aiuta a capire quali geni, compresi i fattori di trascrizione, possono regolare lo sviluppo della DC. Questa tecnica fornisce un modo semplice e veloce per identificare un gene che controlla lo sviluppo di DC dal loro progenitore in vitro.
Per iniziare, mantenere le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche immortalizzate o iHSPC in mezzo COMPLETO RPMI 1640, integrato con 100 nanogrammi per millilitro del ligando FLT3 e un beta estradiolo micromolare. Per la trasduzione lentivirale, placcare gli iHSPC in 12 piastre di pozzetto ad una densità di una volta 10 alla quinta cellula per pozzetto e un millilitro di mezzo completo contenente il ligando FLT3, beta estradiolo e polibrene. Quindi, aggiungere il lentivirus che trasporta l'RNA a forcina corta in ciascun pozzetto ad una molteplicità di infezione di 100.
Quindi, ruotare la piastra a 1100 volte g e 37 gradi Celsius per 90 minuti, quindi incubare le cellule infette durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere il polibrene raccogliendo le cellule in tubi da 15 millilitri in centrifugazione, dopo aver sostituito il mezzo con un mezzo completo fresco contenente il ligando FLT3 e beta estradiolo. Dopo altre 24 ore, aggiungere sei microgrammi per millilitro di puromicina al mezzo per selezionare le cellule infette.
Sostituire il mezzo di selezione ogni tre giorni e mantenere le cellule per almeno una settimana per espandere le iHSPC stabilmente trasdotte. Generare e mantenere iHSPC knockdown stabili per LacZ, Tcf4 e Id2 in un mezzo completo integrato con il ligando FLT3 e il beta estradiolo. Per avviare la differenziazione in vitro raccogliere gli iHSPC indifferenziati in tubi da 15 millilitri e pellet le cellule mediante centrifugazione.
Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, risospese le cellule in mezzo completo contenente solo il ligando FLT3 quindi seminarle ad una densità di due volte 10 al quinto vende per millilitro in una piastra a 12 pozzetti. Dopo tre giorni, aggiungere un millilitro di mezzo fresco completo contenente il ligando FLT3.
Dopo altri due giorni, procedere all'analisi delle cellule differenziate mediante citometria a flusso. Per l'analisi citometrica a flusso, pipettare le cellule su e giù due o tre volte nella piastra, quindi raccogliere le cellule in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi e scartare il surnatante prima di risospendere le cellule in 50 microlitri di buffer fax.
Quindi, aggiungere 50 microlitri di anti-CD16 da 32 ibridomi surnatante e incubare per cinque o 10 minuti sul ghiaccio. Quindi, aggiungere anticorpi coniugati con colorante fluorescente direttamente alle cellule e incubare per 15 minuti sul ghiaccio al buio. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di tampone fax e centrifugare il campione.
Dopo la centrifugazione, risospesere le cellule in 100 microlitri di tampone fax e analizzare i campioni mediante citometria a flusso. Dopo il knockdown mediato dall'RNA a forcina corta di LacZ, Tcf4 e Id2 in iHSPCS, la conferma dell'efficienza di knockdown da parte di RTQ-PCR ha mostrato che l'espressione di IHSPC knockdown Tcf4 e Tcf4 era ridotta rispetto a quella delle iHSPC knockdown LacZ. Risultati simili sono stati osservati per l'espressione di Id2 negli iHSPC knockdown di Id2.
Dopo aver coltivato le iHSPC knockdown lacZ per cinque giorni, la frequenza delle cellule CD11c positive, che rappresentano la popolazione di cellule dendritiche, era di circa il 95% Tuttavia, abbattere Tcf4 o Id2 ha leggermente ridotto la generazione di cellule dendritiche CD11c-positive. Ulteriori analisi delle cellule dendritiche CD11c-positive derivate dalle iHSPC knockdown di LacZ hanno rivelato che il 70% erano cellule dendritiche convenzionali mentre il 22% erano cellule dendritiche plasmacitoidi. Le iHSPC knockdown Tcf4 hanno generato una percentuale significativamente più bassa di cellule dendritiche plasmacitoidi controllate dal LacZ knockdown.
Al contrario, gli iHSPC knockdown Id2 hanno generato una percentuale significativamente inferiore di cellule dendritiche convenzionali rispetto ai controlli di knockdown LacZ, ma una percentuale più alta di cellule dendritiche plasmacitoidi. Le infezioni da spin aumentano l'efficienza di trasduzione dello shRNA portatore di lentivirus negli iHSPC. Questa tecnica affronta il ruolo dei fattori di trascrizione e facilita lo studio di altri geni nella trasduzione o nel metabolismo della segnalazione delle citochine, che sono probabilmente coinvolti nello sviluppo della DC.
