Dendritik hücreler veya DC'ler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık sistemini birbirine bağlayan temel bağışıklık hücreleridir. DC'ler heterojen olsa da, bu yöntem transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere hangi genlerin DC gelişimini düzenleyebileceğini anlamamıza yardımcı olur. Bu teknik, DC gelişimini kontrol eden bir geni progenitör in vitrolarından tanımlamak için basit ve hızlı bir yol sağlar.
Başlamak için, ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreleri veya iHSPC'leri, FLT3 ligandının mililitresi başına 100 nanogram ve bir mikromoler beta estradiol ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamında koruyun. Lentiviral transdüksiyon için, iHSPC'leri kuyu başına beşinci hücrelere bir kez 10 ve FLT3 ligand, beta estradiol ve polibren içeren bir mililitre tam ortam yoğunluğunda 12 kuyu plakasında plakalayın. Daha sonra, 100'lük çok miktarda enfeksiyonda her kuyuda kısa saç tokası RNA'sını taşıyan lentivirüs ekleyin.
Daha sonra, plakayı 1100 kez g ve 37 santigrat derecede 90 dakika döndürün, ardından enfekte hücreleri bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, hücreleri santrifüjlemede 15 mililitre tüpe toplayarak polibreni çıkarın, medyayı FLT3 ligand ve beta estradiol içeren taze komple ortamla değiştirdikten sonra. Ek 24 saat sonra, enfekte hücreleri seçmek için ortama mililitre puromisicin başına altı mikrogram ekleyin.
Seçim ortamını her üç günde bir değiştirin ve hücreleri en az bir hafta boyunca muhafaza ederek, saplı bir şekilde transdüklenmiş iHSPC'leri genişletin. LACZ, Tcf4 ve Id2 için FLT3 ligand ve beta estradiol ile birlikte eksiksiz bir ortamda kararlı nakavt iHSPC'leri oluşturun ve koruyun. İn vitro farklılaşmayı başlatmak için farklılaşmamış iHSPC'leri 15 mililitre tüpler halinde toplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri sadece FLT3 ligini içeren tam bir ortamda yeniden depolayın ve daha sonra mililitre başına 12 kuyu plakasına mililitre başına iki kez 10 ila beşinci satış yoğunluğunda tohumlayın. Üç gün sonra, FLT3 ligandını içeren bir mililitre taze tam ortam ekleyin.
Ek iki gün sonra, farklılaştırılmış hücreleri akış sitometrisine göre analiz etmeye devam edin. Akış sitometrik analizi için, hücreleri plakada iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetlayın, ardından hücreleri 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Tüpleri santrifüj edin ve hücreleri 50 mikrolitre faks arabelleği içinde yeniden canlandırmadan önce üst kapağı atın.
Ardından, 32 hibridoma süpernatant tarafından 50 mikrolitre anti-CD16 ekleyin ve buz üzerinde beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, floresan boya konjuge antikorları doğrudan hücrelere ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir mililitre faks arabelleğiyle yıkayın ve örneği santrifüj edin.
Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 100 mikrolitre faks arabelleğine yeniden ayırın ve örnekleri akış sitometrisine göre analiz edin. iHSPCS'de LacZ, Tcf4 ve Id2'nin kısa saç tokası RNA aracılı nakavtlarından sonra, RTQ-PCR tarafından nakavt verimliliğinin onaylanması, Tcf4 ve Tcf4 nakavt iHSPC'lerinin ifadesinin LacZ knockdown iHSPC'lerdekine kıyasla azaldığını gösterdi. Benzer sonuçlar Id2 knockdown iHSPC'lerinde Id2 ifadesi için de gözlenmiştir.
LacZ nakavt iHSPC'leri beş gün boyunca kült ettikten sonra, dendritik hücre popülasyonu temsil eden CD11c pozitif hücrelerin sıklığı% 95 civarındaydı, Ancak Tcf4 veya Id2'yi devirmek CD11c pozitif dendritik hücrelerin neslini biraz azalttı. LacZ nakavt iHSPC'lerinden elde edilen CD11c pozitif dendritik hücrelerin daha fazla analizi, %70'inin geleneksel dendritik hücreler, %22'sinin ise plazmasikoid dendritik hücreler olduğunu ortaya koydu. Tcf4 nakavt iHSPC'leri, LacZ nakavtının kontrol ettiği plazmasikoid dendritik hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir yüzdesini oluşturdu.
Buna karşılık, Id2 nakavt iHSPC'leri LacZ devirme kontrollerinden önemli ölçüde daha düşük bir konvansiyonel dendritik hücre yüzdesi, ancak plazmasikoid dendritik hücrelerin daha yüksek bir yüzdesini oluşturdu. Spin enfeksiyonları lentivirüs taşıyan shRNA'nın iHSPC'lere transdüksiyon verimliliğini arttırır. Bu teknik transkripsiyon faktörlerinin rolünü ele almak ve DC gelişiminde rol alması muhtemel sitokin sinyal transdüksiyon veya metabolizmada diğer genlerin çalışmasını kolaylaştırır.
