足骨造茎および前駆細胞株における短いヘアピンRNA媒介遺伝子ノックダウンによる樹状細胞の発達に関する研究

樹状細胞、またはDCは、先天性および適応免疫系を結びつける重要な免疫細胞である。DCは異種ですが、この方法は、転写因子を含むどの遺伝子がDCの発達を調節するかを理解するのに役立ちます。この技術は、インビトロの前駆物質からDCの発達を制御する遺伝子を同定する簡単かつ迅速な方法を提供する。

まず、不死化造血幹細胞および前駆細胞またはiHSpcsを完全なRPMI 1640培地で維持し、FLT3リガンドの1ミリリットル当たり100ナノグラムおよび1マイクロモルベータエストラジオールを添加する。レンチウイルス伝達の場合、iHSPCsを12ウェルプレートに10~5番目の細胞の密度でプレートし、FLT3リガンド、ベータエストラジオール、ポリブレンを含む完全な培地を1ミリリットルずつプレートします。次いで、100の感染の多重度で各ウェルに短いヘアピンRNAを運ぶレンチウイルスを加える。

次に、プレートを1100倍gと37度で90分間回転させ、感染した細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、遠心分離で細胞を15ミリリットルのチューブに集めてポリブレンを取り除き、FLT3リガンドおよびβエストラジオールを含む新鮮な完全培地に培地を置き換える。さらに24時間後、ミズにピューロマイシン1ミリリットル当たり6マイクログラムを加えて、感染した細胞を選択します。

3日ごとに選択培地を交換し、少なくとも1週間は細胞を維持して安定して導入されたiHSPを拡大します。FLT3リガンドとベータエストラジオールを添加した完全培地で、LacZ、Tcf4、およびId2の安定したノックダウンiHSPCsを生成し維持します。インビトロ分化を開始するには、未分化iHSPを15ミリリットルのチューブに集め、遠心分離によって細胞をペレットにする。

遠心分離後、上清を捨て、10ミリリットルのPBSで細胞を2回洗います。2回目の洗浄後、FLT3リガンドのみを含む完全な培地で細胞を再懸濁し、1ミリリットル当たりの10分の2の密度で播種し、12ウェルプレートに入れます。3日後、FLT3リガンドを含む新鮮な完全培地を1ミリリットル加える。

さらに2日後、フローサイトメトリーによる分化細胞の分析に進みます。フローサイトメトリック解析では、細胞をプレート内で2〜3回上下し、細胞を1.5ミリリットルのチューブに集めます。チューブを遠心分離し、上清を捨ててから、50マイクロリットルのファックスバッファーで細胞を再懸濁させます。

次に、抗CD16を32ハイブリドーマ上清で50マイクロリットル加え、氷上で5~10分間インキュベートする。次に、蛍光色素共役抗体を細胞に直接加え、暗闇の中で氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルのファックスバッファーで細胞を洗浄し、サンプルを遠心分離します。

遠心分離後、100マイクロリットルのファクスバッファーで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーでサンプルを分析します。iHSPCSにおけるLacZ、Tcf4、およびId2の短いヘアピンRNA媒介性ノックダウンの後、RTQ-PCRによるノックダウン効率の確認は、LacZノックダウンiHSPCsのそれと比較してTcf4およびTcf4ノックダウンiHSPCsの発現が減少したことを示した。同様の結果は、Id2ノックダウンiHSPでId2発現について観察された。

LacZノックダウンiHSPを5日間培養した後、樹状細胞集団を表すCD11c陽性細胞の頻度は約95%であったが、Tcf4またはId2をノックダウンするとCD11c陽性樹状細胞の生成がわずかに減少した。LacZノックダウンiHSPに由来するCD11c陽性樹状細胞のさらなる分析により、従来の樹状細胞は70%、22%が血漿細胞系樹状細胞であったことが明らかになった。Tcf4ノックダウンiHSPCsは、LacZノックダウン制御する血漿細胞樹状細胞の有意に低い割合を生成した。

対照的に、Id2ノックダウンiHSPCsは、LacZノックダウンコントロールよりも従来の樹状細胞の有意に低い割合を生成したが、血漿細胞細胞樹状細胞の割合が高い。スピン感染は、レンチウイルスを運ぶshRNAをiHSPCsに伝達する効率を高める。この技術は、転写因子の役割に対処し、DCの発達に関与する可能性が高いサイトカインシグナル伝達または代謝における他の遺伝子の研究を容易にする。