תאים דנדריטיים, או DCs, הם תאי חיסון מרכזיים המקשרים את מערכת החיסון המולדת והנרכשת. בעוד DCs הם הטרוגניים, שיטה זו מסייעת לנו להבין אילו גנים, כולל גורמי שעתוק, עשויים לווסת את התפתחות DC. טכניקה זו מספקת דרך פשוטה ומהירה לזהות גן השולט בהתפתחות DC מן האב הקדמה שלהם במבחנה.
כדי להתחיל, לשמור על גזע hematopoietic מונצח ותאי אב או iHSPCs במדיום RPMI 1640 מלא, בתוספת 100 ננוגרם למיליליטר של ליגנד FLT3 ו אסטרדיול בטא מיקרומולרי אחד. עבור transduction lentiviral, צלחת iHSPCs ב 12 צלחות היטב בצפיפות של אחד פעמים 10 לתאים החמישיים לכל באר ומיליליטר אחד של מדיום מלא המכיל את ליגנד FLT3, בטא אסטרדיול, פוליברן. לאחר מכן, מוסיפים את lentivirus נושא את RNA סיכת הראש הקצרה בכל באר בריבוי של זיהום של 100.
לאחר מכן, לסובב את הצלחת ב 1100 פעמים g ו 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, ולאחר מכן לדגור על התאים הנגועים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את polybrene על ידי איסוף התאים לתוך 15 צינורות מיליליטר בצנטריפוגה, לאחר החלפת התקשורת עם מדיום מלא טרי המכיל את ליגנד FLT3 ו בטא אסטרדיול. לאחר 24 שעות נוספות, להוסיף שישה מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין למדיום כדי לבחור את התאים הנגועים.
החלף את מדיום הבחירה כל שלושה ימים ושמור על התאים למשך שבוע אחד לפחות כדי להרחיב את ה- iHSPCs שהועברו ביציבות. צור ולשמור על iHSPCs נוקאאוט יציב עבור LacZ, Tcf4, ו- Id2 במדיום מלא בתוספת עם ליגנד FLT3 אסטרדיול בטא. כדי ליזום בידול במבחנה לאסוף את iHSPCs מובחן לתוך 15 צינורות מיליליטר גלולה התאים על ידי צנטריפוגה.
לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS. לאחר השטיפה השנייה, resuspend התאים במדיום מלא המכיל רק את ליגנד FLT3 ואז לזרוע אותם בצפיפות של פעמיים 10 עד החמישי מוכר לכל מיליליטר לתוך צלחת 12 באר. לאחר שלושה ימים, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום שלם טרי המכיל את ליגנד FLT3.
לאחר יומיים נוספים, המשך לנתח את התאים המובחנים על ידי cytometry זרימה. לניתוח ציטומטרי זרימה, פיפטה התאים למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים בצלחת ולאחר מכן לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגות הצינורות ולהשליך את supernatant לפני resuspending התאים ב 50 מיקרוליטרים של מאגר פקס.
לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של אנטי CD16 על ידי 32 היברידית supernatant ודגור במשך חמש עד 10 דקות על קרח. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים מצומדים בצבע פלואורסצנטי ישירות לתאים ודגרו במשך 15 דקות על קרח בחושך. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר פקס צנטריפוגה המדגם.
לאחר צנטריפוגה, resuspened התאים ב 100 מיקרוליטרים של מאגר פקס ולנתח את הדגימות על ידי cytometry זרימה. לאחר נוקאאוט קצר בתיווך RNA של LacZ, Tcf4, ו- Id2 ב- iHSPCS, אישור של יעילות נוקאאוט על ידי RTQ-PCR הראה כי הביטוי של Tcf4 ו- Tcf4 לדפוק iHSPCs הופחת בהשוואה לזה ב- iHSPCs נוקאאוט LacZ. תוצאות דומות נצפו עבור ביטוי Id2 ב- iHSPCs הנוקאאוט Id2.
לאחר פולחן LacZ לדפוק iHSPCs במשך חמישה ימים, התדירות של תאים חיוביים CD11c, המייצגים את אוכלוסיית התאים הדנדריטיים, היה סביב 95%עם זאת, להפיל Tcf4 או Id2 מעט הפחית את הדור של תאים דנדריטיים CD11c חיובי. ניתוח נוסף של תאים דנדריטיים חיוביים CD11c נגזר iHSPCs נוקאאוט LacZ גילה כי 70% היו תאים דנדריטיים קונבנציונליים בעוד 22% היו תאים דנדריטיים פלזמה. IHSPCs נוקאאוט Tcf4 יצר אחוז נמוך משמעותית של תאים דנדריטיים פלסמציטויד כי בקרת הנוקאאוט LacZ.
לעומת זאת, iHSPCs נוקאאוט Id2 יצרו אחוז נמוך משמעותית של תאים דנדריטיים קונבנציונליים מאשר בקרות הנוקאאוט של LacZ, אך אחוז גבוה יותר של תאים דנדריטיים פלסמהציטואידים. זיהומים ספין להגדיל את יעילות ההמרה של shRNA נושאת lentivirus לתוך iHSPCs. טכניקה זו מתייחסת לתפקידם של גורמי שעתוק ומאפשרת את המחקר של גנים אחרים בציטוקינים איתות טרנסדוקציה או חילוף חומרים, אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח DC.
