Этот протокол позволяет понять, как отдельные типы клеток, присутствующие в кишечном эпителии человека, реагируют на вирусную инфекцию. Здесь мы представляем три независимых способа засеять кишечные органоиды человека, чтобы решить, как путь инфекции может повлиять на реакцию клетки. Мы расскажем о том, как подготовить образцы для секвенирования одноклеточной РНК с учетом правил биобезопасности, которые необходимо соблюдать при работе с патогенами категории 3.
Этот метод может быть легко адаптирован к другим патогенам и органоидным культурам. Наиболее важным соображением является обеспечение того, чтобы ваши органоидные модели были полностью дифференцированы с выбранным методом посева и могли поддерживать вирусную инфекцию. Перед забором зараженных органоидов удалите одноклеточные гелевые шарики от минус 80 градусов Цельсия и согрейте их до комнатной температуры.
Кроме того, уравновешивают реагент RT, восстановитель B и фермент RT C до комнатной температуры и повторно суспендируют олиго переключателя шаблона, как описано в инструкциях производителя. Далее, чтобы собрать 3D органоиды, зараженные возбудителем BSL-3, снимите пластинку клеточной культуры из инкубатора и поместите ее в вытяжку клеточной культуры. Затем, используя пипетку P1000, удалите дифференцирующую среду из каждой лунки 24-луночной пластины, добавьте 500 микролитров ледяного холода PBS в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение трех минут.
Затем, чтобы полностью нарушить раствор внеклеточного матрикса, пипетку вверх и вниз 10 раз, чтобы повторно суспендировать PBS, внеклеточный матрикс и органоиды, затем перенести повторно суспендированные органоиды в коническую трубку объемом 15 миллилитров и поместить трубки на лед. Соберите каждое инфекционное состояние в отдельные конические трубки по 15 миллилитров. После смены перчаток очистите внешнюю часть трубки и извлеките трубку из вытяжки клеточной культуры.
Вращайте образцы в течение пяти минут. Переместите трубку обратно в вытяжку клеточной культуры и удалите PBS, избегая повторного суспендирования гранул органоида со дна трубки. Далее повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре фермента диссоциации.
затем смените перчатки, очистите трубку и высиживайте образцы при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Во время инкубации перемещайте трубку обратно в вытяжку клеточной культуры каждые 10 минут и повторно суспендируйте органоиды, пипетируя вверх и вниз. Чтобы определить, диссоциируются ли органоиды на отдельные клетки, поместите 10 микролитров органоидной суспензии в одноразовый пластиковый слайд счетчика клеток с помощью пипетки P10, затем запечатайте входной порт образца прозрачной лентой.
После смены перчаток очистите внешнюю сторону счетчика клеток и с помощью микроскопа Brightfield подтвердите, что создана одноклеточная суспензия. После подтверждения одноклеточной суспензии остановите пищеварение, добавив один миллилитр среды DMEM F12, содержащей 10% FBS и пипетку вверх и вниз 10 раз. Затем смените перчатки, очистите трубку и раскрутите образец.
После центрифугирования осторожно удалите среду, содержащую фермент диссоциации, заботясь о том, чтобы не потревожить клеточную гранулу на дне. Затем повторно суспендируют отдельные ячейки в минимальном объеме PBS, содержащем 0,1% BSA. После пропускания клеточной суспензии в трубку FACS через фильтр для удаления больших скоплений поместите трубку на лед.
Затем, чтобы определить количество ячеек на микролитр, добавьте 10 микролитров клеточной суспензии в одноразовую пластиковую камеру подсчета ячеек. Затем запечатайте входной порт образца прозрачной лентой перед извлечением образца из вытяжки клеточной культуры. Смените перчатки, очистите камеру подсчета клеток, затем подсчитайте количество клеток с помощью микроскопа Brightfield.
Затем внутри вытяжки клеточной культуры приготовьте мастер-смесь реагента RT, олиго переключателя шаблона, восстановителя B и фермента RT C в пробирке объемом 1,5 миллилитра в соответствии с инструкциями производителя в зависимости от количества образцов в эксперименте. Для каждого образца аликвотирует 33,4 микролитра мастер-смеси в ПЦР-трубку, затем добавляют клетки и воду в мастер-микс в соответствии с целевым номером клеток. После смены перчаток переместите одноклеточный контроллер в капюшон клеточной культуры и подготовьте чип.
Затем добавьте одноэлементный чип в держатель чипа и заполните неиспользуемые полосы 50% глицерином. Добавьте основную смесь, бусины и масло для перегородок в полосы, содержащие образцы в соответствии с инструкциями производителя, и накройте чип прокладкой. После загрузки чипа в контроллер запустите программу.
По завершении программы снимите стружку и прокладку, затем с помощью многоканальной пипетки переложите 100 микролитров эмульсий на чистые трубки ПЦР. Убедитесь, что каждая эмульсия имеет однородный белый цвет, указывающий на то, что произошла полная эмульсия. После смены перчаток и очистки трубок перенесите трубки ПЦР на аппарат ПЦР и запустите программу.
В конце ПЦР большинство оболочек вирусов будут инактивированы. Здесь показаны репрезентативные изображения Брайтфилда в первый, третий, пятый и семь органоидов после расщепления. В среднем, органоиды расщепляются один раз в неделю, когда центры становятся темными.
Изменяя условия среды, удаляя Wnt-3a и уменьшая R-спондин и ноггин, клеточная сложность, обнаруженная в кишечнике человека, может быть имитирована. Как правило, клеточная дифференцировка в сторону клеток Панета, бокаловидных клеток и энтероцитов требует четырех дней дифференцировки среды. Анализ данных секвенирования одиночных клеток из инфицированных SARS-CoV-2 органоидов толстой кишки и подвздошной кишки человека показал, что только субпопуляция эпителиальных клеток кишечника человека поддерживала инфекцию SARS-CoV-2 через 12 и 24 часа.
Анализ врожденных иммунных реакций в инфицированных SARS-CoV-2 органоидах, полученных из толстой кишки, показал, что SARS-CoV-2 индуцировал провоспалительный сигнальный каскад в инфицированных клетках, в то время как неинфицированные клетки свидетеля показали интерферон-опосредованный иммунный ответ. Кроме того, секвенирование одноклеточной РНК показало, что инфицированные клетки не могут ощущать интерфероны из-за опосредованной вирусом блокировки пути. Органоиды должны быть хорошо дифференцированными и здоровыми.
Это можно контролировать, определяя уровень маркеров дифференцировки клеток с помощью qPCR до заражения. Если клетки плохо дифференцированы, они не будут поддерживать вирусную инфекцию и приведут к неинформативным результатам. Этот метод позволяет нам инфицировать слизистую оболочку как со стороны просвета, так и со стороны ткани.
Это очень важно, поскольку позволяет нам распутать механизмы, используемые поверхностями слизистой оболочки, чтобы переносить грязную среду с одной стороны и стерильную с другой.
