Este protocolo nos permite entender como os tipos de células individuais estão presentes na resposta do epitélio intestinal humano à infecção viral. Nós apresentamos aqui três maneiras independentes de semear organoides intestinais humanos para abordar como a rota da infecção pode impactar como a célula responde. Destacamos como preparar amostras para o sequenciamento de RNA de células únicas considerando os regulamentos de biossegurança que precisam ser respeitados ao trabalhar com patógenos de categoria 3.
Este método pode ser facilmente adaptado a outros patógenos e culturas organoides. A consideração mais importante é garantir que seus modelos organoides sejam totalmente diferenciados com o método de semeadura escolhido e possam suportar a infecção viral. Antes de colher os organoides infectados, remova as contas de gel unicelular de menos 80 graus Celsius e aqueça-as à temperatura ambiente.
Além disso, equilibre o reagente RT, reduzindo a enzima B e a enzima RT à temperatura ambiente e resuspenque o oligo do interruptor de modelo, conforme descrito nas instruções do fabricante. Em seguida, para coletar organoides 3D infectados com o patógeno BSL-3, remova a placa de cultura celular da incubadora e coloque-a na capa de cultura celular. Em seguida, usando uma pipeta P1000, remova a mídia de diferenciação de cada poço da placa de 24 poços, adicione 500 microliters de PBS gelado a cada poço e incubar em temperatura ambiente por três minutos.
Em seguida, para interromper totalmente a solução de matriz extracelular, pipeta para cima e para baixo 10 vezes para resuspend o PBS, matriz extracelular e organoides, em seguida, transferir os organoides resuspended em um tubo cônico de 15 mililitros e colocar os tubos no gelo. Colete cada condição de infecção em tubos cônicos separados de 15 mililitros. Depois de trocar as luvas, limpe o lado de fora do tubo e remova o tubo da capa de cultura celular.
Gire as amostras por cinco minutos. Mova o tubo de volta para a capa de cultura celular e remova o PBS, evitando a ressuspensão da pelota do organoide a partir da parte inferior do tubo. Em seguida, resuspense a pelota em um mililitro de enzima dissociação.
em seguida, troque as luvas, limpe o tubo e incuba as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante a incubação, mova o tubo de volta para a capa de cultura celular a cada 10 minutos e resuspense os organoides pipetando para cima e para baixo. Para determinar se os organoides são dissociados em células únicas, coloque 10 microliters da suspensão organoide em um disto de contador de células plásticas descartáveis usando uma pipeta P10 e, em seguida, sele a porta de entrada da amostra com fita transparente.
Depois de trocar luvas, limpe o lado de fora do balcão da célula e usando um microscópio Brightfield, confirme que uma única suspensão celular é criada. Após a confirmação da suspensão celular única, pare a digestão adicionando um mililitro de mídia DMEM F12 contendo 10% de FBS e pipeta para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, troque as luvas, limpe o tubo e gire a amostra.
Após a centrifugação, remova cuidadosamente a mídia contendo a enzima dissociação, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular na parte inferior. Em seguida, resuspenha as células únicas em um volume mínimo de PBS contendo 0,1% BSA. Depois de passar a suspensão da célula em um tubo FACS através de um filtro para remover grandes aglomerados, coloque o tubo no gelo.
Em seguida, para determinar o número de células por microliter, adicione 10 microliters da suspensão celular a uma câmara de contagem de células plásticas descartáveis. Em seguida, sele a porta de entrada da amostra com fita clara antes de remover a amostra da capa de cultura celular. Troque as luvas, limpe a câmara de contagem de células, então conte o número de células usando um microscópio Brightfield.
Em seguida, dentro da capa de cultura celular, prepare uma mistura mestre de reagente RT, oligo de interruptor de modelo, reduzindo o agente B e a enzima RT C em um tubo de 1,5 mililitro, de acordo com as instruções do fabricante, dependendo do número de amostras no experimento. Para cada amostra, alíquota de 33,4 microliters de mistura mestre em um tubo PCR, em seguida, adicione as células e a água à mistura mestre de acordo com o número da célula alvo. Depois de trocar luvas, mova o controlador de célula única para o capô de cultura celular e prepare o chip.
Em seguida, adicione o chip de célula única no suporte do chip e encha as pistas nãousadas com 50% de glicerol. Adicione a mistura mestre, as contas e o óleo de particionamento nas pistas que contenham amostras de acordo com as instruções do fabricante e cubra o chip com uma junta. Depois de carregar o chip no controlador, inicie o programa.
Após a conclusão do programa, remova o chip e a junta, em seguida, usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microliters das emulsões para limpar tubos PCR. Certifique-se de que cada emulsão tenha uma cor branca uniforme indicando que ocorreu uma emulsão completa. Depois de trocar luvas e limpar os tubos, transfira os tubos PCR para uma máquina PCR e inicie o programa.
No final da execução do PCR, a maioria dos vírus envoltos serão inativados. As imagens representativas de Brightfield nos dias um, três, cinco e sete organoides pós-divisão são mostradas aqui. Em média, os organoides são divididos uma vez por semana quando os centros ficam escuros.
Alterando as condições da mídia, removendo wnt-3a e reduzindo R-spondin e noggin, a complexidade celular encontrada dentro do intestino humano pode ser imitada. Normalmente, a diferenciação celular em relação às células paneth, células de cálice e enterócitos requer quatro dias de mídia de diferenciação. A análise dos dados de sequenciamento de células únicas do SARS-CoV-2 infectou cólon humano e organoides derivados de ípio mostrou que apenas uma subpopulação de células epiteliais intestinais humanas apoiou a infecção do SARS-CoV-2 após 12 e 24 horas.
A análise das respostas imunes inatas em organoides derivados do cólon infectados pelo SARS-CoV-2 mostrou que o SARS-CoV-2 induziu uma cascata de sinal pró-inflamatório em células infectadas, enquanto células de espectadores não infectadas mostraram uma resposta imune mediada por interferon. Além disso, o sequenciamento de RNA de células únicas mostrou que as células infectadas não conseguiam sentir interferons devido ao bloqueio mediado pelo vírus da via. Os organoides devem ser bem diferenciados e saudáveis.
Isso pode ser controlado determinando o nível de marcadores de diferenciação celular por qPCR antes da infecção. Se as células não forem bem diferenciadas, elas não suportarão a infecção viral e levarão a resultados não informativos. Esta técnica nos permite infectar a mucosa tanto do lado luminal quanto do tecido.
Isso é muito importante, pois nos permite desvendar mecanismos usados pelas superfícies mucosas para tolerar um ambiente sujo de um lado e um estéril do outro.
