يسمح لنا هذا البروتوكول بفهم كيفية استجابة أنواع الخلايا الفردية الموجودة في استجابة ظهارة الأمعاء البشرية للعدوى الفيروسية. نحن هنا نقدم ثلاث طرق مستقلة لزرع الأعضاء المعوية البشرية لمعالجة كيف يمكن أن يؤثر مسار العدوى على كيفية استجابة الخلية. نسلط الضوء على كيفية إعداد عينات لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة النظر في لوائح السلامة البيولوجية التي تحتاج إلى احترام عند العمل مع مسببات الأمراض من الفئة 3.
يمكن بسهولة تكييف هذه الطريقة مع مسببات الأمراض الأخرى والثقافات العضوية. الاعتبار الأكثر أهمية هو التأكد من أن نماذج الجهازية الخاصة بك متمايزة تماما مع طريقة البذر المختارة ويمكن أن تدعم العدوى الفيروسية. قبل حصاد الأجهزة المصابة ، قم بإزالة حبات هلام الخلية الواحدة من ناقص 80 درجة مئوية وتدفئتها إلى درجة حرارة الغرفة.
بالإضافة إلى ذلك، قم بتوازن كاشف RT، مما يقلل من العامل B، وانزيم RT C إلى درجة حرارة الغرفة واقلل أوليغو مفتاح القالب كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، لجمع الأجهزة العضوية ثلاثية الأبعاد المصابة بمسببات الأمراض BSL-3 ، قم بإزالة لوحة ثقافة الخلية من الحاضنة ووضعها في غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية. ثم باستخدام ماصة P1000 ، وإزالة وسائل الإعلام التمايز من كل بئر من لوحة 24 جيدا ، إضافة 500 ميكرولتر من الجليد البارد PBS إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.
بعد ذلك ، لتعطيل حل المصفوفة خارج الخلية بالكامل ، قم بإعادة إنفاق برنامج تلفزيوني ، مصفوفة خارج الخلية ، وعضيات ، ثم نقل الأجهزة العضوية التي أعيد إنفاقها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ووضع الأنابيب على الجليد. جمع كل حالة العدوى في أنابيب مخروطية منفصلة 15 ملليلتر. بعد تغيير القفازات، تنظيف الجزء الخارجي من الأنبوب وإزالة الأنبوب من غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
تدور العينات لمدة خمس دقائق. نقل أنبوب العودة إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية وإزالة برنامج تلفزيوني، وتجنب إعادة الإنفاق من بيليه organoid من الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك، إعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من إنزيم التفكك.
ثم تغيير القفازات، وتنظيف الأنبوب، واحتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أثناء الحضانة، نقل الأنبوب مرة أخرى إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية كل 10 دقائق وإعادة إنفاق organoids عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. لتحديد ما إذا كانت organoids يتم تقسيمها إلى خلايا واحدة، ضع 10 ميكرولترات من التعليق organoid في شريحة عداد الخلايا البلاستيكية المتاح باستخدام ماصة P10، ثم ختم منفذ إدخال العينة مع شريط واضح.
بعد تغيير القفازات، وتنظيف خارج عداد الخلية واستخدام المجهر برايتفيلد، تأكد من أن يتم إنشاء تعليق خلية واحدة. بعد تأكيد تعليق خلية واحدة، وقف الهضم بإضافة ملليلتر واحد من وسائط F12 DMEM تحتوي على 10٪ FBS وماصة صعودا وهبوطا 10 مرات. ثم تغيير القفازات، وتنظيف الأنبوب وتدور العينة.
بعد الطرد المركزي، قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على إنزيم التفكك بعناية، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية في الأسفل. ثم إعادة إنفاق الخلايا المفردة في الحد الأدنى من حجم برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA. بعد تمرير تعليق الخلية إلى أنبوب FACS من خلال مرشح لإزالة كتل كبيرة، ضع الأنبوب على الجليد.
بعد ذلك ، لتحديد عدد الخلايا لكل ميكرولتر ، أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى غرفة عد الخلايا البلاستيكية القابلة للتصرف. ثم ختم منفذ إدخال العينة بشريط واضح قبل إزالة العينة من غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. تغيير القفازات، وتنظيف غرفة عد الخلايا، ثم عد عدد الخلايا باستخدام المجهر برايتفيلد.
بعد ذلك ، داخل غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية ، وإعداد مزيج رئيسي من كاشف RT ، قالب التبديل أوليغو ، والحد من عامل باء ، وRT انزيم C في أنبوب 1.5 ملليلتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة اعتمادا على عدد العينات في التجربة. لكل عينة، aliquot 33.4 ميكرولتر من مزيج رئيسي في أنبوب PCR، ثم إضافة الخلايا والماء إلى المزيج الرئيسي وفقا لعدد الخلية المستهدفة. بعد تغيير القفازات، قم بتحريك وحدة تحكم الخلية المفردة إلى غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية وإعداد الشريحة.
بعد ذلك، إضافة رقاقة خلية واحدة في حامل رقاقة وملء الممرات غير المستخدمة مع 50٪ glycerol. إضافة المزيج الرئيسي والخرز، وتقسيم النفط إلى الممرات التي تحتوي على عينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتغطية رقاقة مع طوقا. بعد تحميل الشريحة في وحدة التحكم، ابدأ البرنامج.
عند الانتهاء من البرنامج، وإزالة رقاقة وحشية، ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات، ونقل 100 ميكرولتر من المستحلبات لتنظيف أنابيب PCR. تأكد من أن كل مستحلب له لون أبيض موحد يشير إلى حدوث مستحلب كامل. بعد تغيير القفازات وتنظيف الأنابيب، نقل أنابيب PCR إلى جهاز PCR وبدء البرنامج.
في نهاية تشغيل PCR، سيتم تعطيل معظم الفيروسات المغلفة. تظهر هنا صور الممثل برايتفيلد في الأيام الأولى والثلاثة والخامسة والسابعة بعد التقسيم. في المتوسط ، يتم تقسيم organoids مرة واحدة في الأسبوع عندما تصبح المراكز مظلمة.
من خلال تغيير ظروف وسائل الإعلام ، وإزالة Wnt-3a والحد من R-spondin و noggin ، يمكن محاكاة التعقيد الخلوي الموجود داخل الأمعاء البشرية. عادة، التمايز الخلوي نحو خلايا بانيث، خلايا الكؤوس، و enterocytes يتطلب أربعة أيام من وسائل الإعلام التمايز. اظهر تحليل بيانات تسلسل الخلايا المفردة من القولون البشرى المصاب بالسارس - كوف - 2 والاعضاء المشتقة من الييوم ان نسبة فرعية من الخلايا الظهارية المعوية البشرية فقط تدعم عدوى السارس - كوف - 2 بعد 12 و 24 ساعة .
وقد اظهر تحليل الاستجابات المناعية الفطرية فى الاعضاء المشتقة من القولون المصابة بالسارس - كو فى - 2 ان السارس - كوف - 2 تسبب فى سلسلة اشارات مؤيدة للالتهابات فى الخلايا المصابة بينما اظهرت خلايا المارة غير المصابة استجابة مناعية بوساطة التداخل . بالإضافة إلى ذلك، أظهر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أن الخلايا المصابة لم تكن قادرة على استشعار الإنترفيرونات بسبب انسداد المسار بوساطة الفيروس. يجب أن تكون الأجهزة العضوية متميزة وصحية.
ويمكن التحكم في ذلك عن طريق تحديد مستوى علامات تمايز الخلايا عن طريق qPCR قبل العدوى. إذا لم تكن الخلايا متباينة بشكل جيد ، فإنها لن تدعم العدوى الفيروسية وتؤدي إلى نتائج غير مفيدة. هذه التقنية تسمح لنا بإصابة الغشاء المخاطي من جانب كل من الإنارة والأنسجة.
هذا هو المفتاح جدا لأنه يسمح لنا لكشف الآليات المستخدمة من قبل السطوح المخاطية لتحمل بيئة قذرة على جانب واحد ومعقمة من ناحية أخرى.
