Ce protocole nous permet de comprendre comment les types de cellules individuelles présentes dans l’épithélium intestinal humain réagissent à l’infection virale. Nous présentons ici trois façons indépendantes d’ensemencer des organoïdes intestinaux humains pour déterminer comment la voie d’infection peut avoir un impact sur la façon dont la cellule réagit. Nous soulignons comment préparer des échantillons pour le séquençage de l’ARN unicellulaire en tenant compte des règlements de biosécurité qui doivent être respectés lorsque l’on travaille avec des agents pathogènes de catégorie 3.
Cette méthode peut facilement être adaptée à d’autres agents pathogènes et cultures organoïdes. La considération la plus importante est de s’assurer que vos modèles organoïdes sont complètement différenciés avec la méthode d’ensemencement choisie et peuvent soutenir l’infection virale. Avant de prélever les organoïdes infectés, retirez les billes de gel unicellulaire de moins 80 degrés Celsius et réchauffez-les à la température ambiante.
De plus, équilibrez le réactif RT, l’agent réducteur B et l’enzyme RT C à la température ambiante et remettez en suspension l’oligo du commutateur de gabarit comme décrit dans les instructions du fabricant. Ensuite, pour collecter les organoïdes 3D infectés par l’agent pathogène BSL-3, retirez la plaque de culture cellulaire de l’incubateur et placez-la dans la hotte de culture cellulaire. Ensuite, à l’aide d’une pipette P1000, retirez le média de différenciation de chaque puits de la plaque de 24 puits, ajoutez 500 microlitres de PBS glacé à chaque puits et incubez à température ambiante pendant trois minutes.
Ensuite, pour perturber complètement la solution de matrice extracellulaire, pipettez de haut en bas 10 fois pour remettre en suspension le PBS, la matrice extracellulaire et les organoïdes, puis transférez les organoïdes remis en suspension dans un tube conique de 15 millilitres et placez les tubes sur de la glace. Recueillir chaque condition d’infection dans des tubes coniques séparés de 15 millilitres. Après avoir changé de gants, nettoyez l’extérieur du tube et retirez le tube de la hotte de culture cellulaire.
Faites tourner les échantillons pendant cinq minutes. Replacez le tube dans la hotte de culture cellulaire et retirez le PBS, en évitant la remise en suspension de la pastille de l’organoïde par le fond du tube. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un millilitre d’enzyme de dissociation.
puis changez de gants, nettoyez le tube et incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, replacez le tube dans la hotte de culture cellulaire toutes les 10 minutes et remettez en suspension les organoïdes en pipetant de haut en bas. Pour déterminer si les organoïdes sont dissociés en cellules uniques, placez 10 microlitres de la suspension organoïde dans une glissière de compteur de cellules en plastique jetable à l’aide d’une pipette P10, puis scellez le port d’entrée de l’échantillon avec du ruban adhésif transparent.
Après avoir changé de gants, nettoyez l’extérieur du compteur de cellules et, à l’aide d’un microscope Brightfield, confirmez qu’une suspension à cellule unique est créée. Après confirmation de la suspension à cellule unique, arrêtez la digestion en ajoutant un millilitre de milieu DMEM F12 contenant 10% de FBS et pipette de haut en bas 10 fois. Ensuite, changez les gants, nettoyez le tube et faites tourner l’échantillon.
Après centrifugation, retirez soigneusement les milieux contenant l’enzyme de dissociation, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire au fond. Ensuite, remettez en suspension les cellules individuelles dans un volume minimal de PBS contenant 0,1% de BSA. Après avoir passé la suspension cellulaire dans un tube FACS à travers un filtre pour éliminer les gros amas, placez le tube sur de la glace.
Ensuite, pour déterminer le nombre de cellules par microlitre, ajoutez 10 microlitres de la suspension cellulaire à une chambre de comptage de cellules en plastique jetable. Scellez ensuite le port d’entrée de l’échantillon avec du ruban adhésif transparent avant de retirer l’échantillon de la hotte de culture cellulaire. Changez de gants, nettoyez la chambre de comptage des cellules, puis comptez le nombre de cellules à l’aide d’un microscope à fond clair.
Ensuite, à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire, préparez un mélange maître de réactif RT, d’oligo de commutateur de gabarit, d’agent réducteur B et d’enzyme RT C dans un tube de 1,5 millilitre selon les instructions du fabricant en fonction du nombre d’échantillons dans l’expérience. Pour chaque échantillon, aliquote 33,4 microlitres de mélange maître dans un tube PCR, puis ajoutez les cellules et l’eau au mélange maître en fonction du nombre de cellules cibles. Après avoir changé de gants, déplacez le contrôleur à cellule unique dans la cagoule de culture cellulaire et préparez la puce.
Ensuite, ajoutez la puce à cellule unique dans le porte-puce et remplissez les voies inutilisées avec 50% de glycérol. Ajoutez le mélange principal, les perles et l’huile de cloisonnement dans les voies contenant des échantillons conformément aux instructions du fabricant et recouvrez la puce d’un joint. Après avoir chargé la puce dans le contrôleur, démarrez le programme.
À la fin du programme, retirez la puce et le joint, puis à l’aide d’une pipette multicanal, transférez 100 microlitres des émulsions pour nettoyer les tubes PCR. Assurez-vous que chaque émulsion a une couleur blanche uniforme indiquant qu’une émulsion complète s’est produite. Après avoir changé de gants et nettoyé les tubes, transférez les tubes PCR sur une machine PCR et démarrez le programme.
À la fin de l’exécution de la PCR, la plupart des virus enveloppés seront inactivés. Les images représentatives de Brightfield aux jours un, trois, cinq et sept organoïdes post-scission sont montrées ici. En moyenne, les organoïdes sont divisés une fois par semaine lorsque les centres deviennent sombres.
En modifiant les conditions du milieu, en éliminant Wnt-3a et en réduisant la R-spondine et le noggin, la complexité cellulaire trouvée dans l’intestin humain peut être imitée. Normalement, la différenciation cellulaire vers les cellules de Paneth, les cellules de gobelet et les entérocytes nécessite quatre jours de milieu de différenciation. L’analyse des données de séquençage unicellulaire provenant d’organoïdes du côlon humain et de l’iléon infectés par le SRAS-CoV-2 a montré que seule une sous-population de cellules épithéliales intestinales humaines soutenait l’infection par le SARS-CoV-2 après 12 et 24 heures.
L’analyse des réponses immunitaires innées dans les organoïdes dérivés du côlon infectés par le SRAS-CoV-2 a montré que le SARS-CoV-2 induisait une cascade de signaux pro-inflammatoires dans les cellules infectées tandis que les cellules témoins non infectées présentaient une réponse immunitaire médiée par l’interféron. De plus, le séquençage de l’ARN unicellulaire a montré que les cellules infectées étaient incapables de détecter les interférons en raison du blocage de la voie médié par le virus. Les organoïdes doivent être bien différenciés et sains.
Cela peut être contrôlé en déterminant le niveau de marqueurs de différenciation cellulaire par qPCR avant l’infection. Si les cellules ne sont pas bien différenciées, elles ne soutiendront pas l’infection virale et conduiront à des résultats non informatifs. Cette technique nous permet d’infecter la muqueuse à la fois du côté luminal et du côté tissulaire.
C’est très important car cela nous permet de démêler les mécanismes utilisés par les surfaces muqueuses pour tolérer un environnement sale d’un côté et un environnement stérile de l’autre.
