Questo protocollo ci permette di capire come i singoli tipi di cellule presenti nell'epitelio intestinale umano rispondono all'infezione virale. Qui presentiamo tre modi indipendenti per seminare organoidi intestinali umani per affrontare il modo in cui la via di infezione può influire sul modo in cui la cellula risponde. Evidenziamo come preparare campioni per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula considerando le normative sulla biosicurezza che devono essere rispettate quando si lavora con agenti patogeni di categoria 3.
Questo metodo può essere facilmente adattato ad altri agenti patogeni e colture organoidi. La considerazione più importante è assicurarsi che i modelli di organoidi siano completamente differenziati con il metodo di semina scelto e possano supportare l'infezione virale. Prima di raccogliere gli organoidi infetti, rimuovere le perle di gel unicellulare da meno 80 gradi Celsius e riscaldarle a temperatura ambiente.
Inoltre, equilibrare il reagente RT, l'agente riducente B e l'enzima RT C a temperatura ambiente e risospessire l'oligo interruttore modello come descritto nelle istruzioni del produttore. Successivamente, per raccogliere organoidi 3D infetti dal patogeno BSL-3, rimuovere la piastra di coltura cellulare dall'incubatore e posizionarla nella cappa di coltura cellulare. Quindi, utilizzando una pipetta P1000, rimuovere il mezzo di differenziazione da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, aggiungere 500 microlitri di PBS ghiacciato a ciascun pozzo e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.
Successivamente, per interrompere completamente la soluzione della matrice extracellulare, pipettare su e giù 10 volte per risospese il PBS, la matrice extracellulare e gli organoidi, quindi trasferire gli organoidi risospesi in un tubo conico da 15 millilitri e posizionare i tubi sul ghiaccio. Raccogliere ogni condizione di infezione in tubi conici separati da 15 millilitri. Dopo aver cambiato i guanti, pulire l'esterno del tubo e rimuovere il tubo dal cappuccio di coltura cellulare.
Girare i campioni per cinque minuti. Spostare nuovamente il tubo nella cappa di coltura cellulare e rimuovere il PBS, evitando la risospensione del pellet dell'organoide dal fondo del tubo. Quindi, risospesare il pellet in un millilitro di enzima di dissociazione.
quindi cambiare i guanti, pulire il tubo e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, spostare nuovamente il tubo nella cappa di coltura cellulare ogni 10 minuti e risospesciare gli organoidi tubando su e giù. Per determinare se gli organoidi sono dissociati in singole celle, posizionare 10 microlitri della sospensione organoide in un vetrino monouso in plastica utilizzando una pipetta P10, quindi sigillare la porta di ingresso del campione con nastro trasparente.
Dopo aver cambiato i guanti, pulire l'esterno del contatore cellulare e utilizzando un microscopio Brightfield, confermare che sia stata creata una sospensione a singola cellula. Dopo la conferma della sospensione a cella singola, interrompere la digestione aggiungendo un millilitro di supporto DMEM F12 contenente il 10% di FBS e pipetta su e giù 10 volte. Quindi cambiare i guanti, pulire il tubo e far girare il campione.
Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il mezzo contenente l'enzima di dissociazione, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare sul fondo. Quindi risospesciare le singole celle in un volume minimo di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Dopo aver passato la sospensione cellulare in un tubo FACS attraverso un filtro per rimuovere grandi grumi, posizionare il tubo su ghiaccio.
Successivamente, per determinare il numero di cellule per microlitro, aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a una camera di conteggio delle celle in plastica usa e getta. Quindi sigillare la porta di ingresso del campione con nastro trasparente prima di rimuovere il campione dalla cappa di coltura cellulare. Cambiare i guanti, pulire la camera di conteggio delle cellule, quindi contare il numero di cellule utilizzando un microscopio Brightfield.
Successivamente, all'interno della cappa di coltura cellulare, preparare un mix principale di reagente RT, oligo di commutazione modello, agente riducente B ed enzima RT C in un tubo da 1,5 millilitri secondo le istruzioni del produttore a seconda del numero di campioni nell'esperimento. Per ogni campione, aliquota 33,4 microlitri di master mix in un tubo PCR, quindi aggiungere le cellule e l'acqua alla miscela master in base al numero di cella target. Dopo aver cambiato i guanti, spostare il controller a cella singola nel cappuccio di coltura cellulare e preparare il chip.
Quindi, aggiungere il chip a cella singola nel supporto del chip e riempire le corsie inutilizzate con il 50% di glicerolo. Aggiungere il mix principale, le perline e l'olio di partizionamento alle corsie contenenti campioni secondo le istruzioni del produttore e coprire il chip con una guarnizione. Dopo aver caricato il chip nel controller, avviare il programma.
Al termine del programma, rimuovere il chip e la guarnizione, quindi utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri delle emulsioni per pulire i tubi PCR. Assicurarsi che ogni emulsione abbia un colore bianco uniforme che indichi che si è verificata un'emulsione completa. Dopo aver cambiato i guanti e pulito i tubi, trasferire i tubi PCR su una macchina PCR e avviare il programma.
Alla fine dell'esecuzione della PCR, la maggior parte dei virus avvolti verrà inattivata. Le immagini rappresentative di Brightfield ai giorni uno, tre, cinque e sette organoidi post-scissione sono mostrate qui. In media, gli organoidi vengono divisi una volta alla settimana quando i centri diventano scuri.
Modificando le condizioni dei media, rimuovendo Wnt-3a e riducendo R-spondin e noggin, la complessità cellulare trovata all'interno dell'intestino umano può essere imitata. Normalmente, la differenziazione cellulare verso le cellule paneth, le cellule caliciformi e gli enterociti richiede quattro giorni di mezzi di differenziazione. L'analisi dei dati di sequenziamento a singola cellula del colon umano infetto da SARS-CoV-2 e degli organoidi derivati dall'ileo ha mostrato che solo una sottopopolazione di cellule epiteliali intestinali umane supportava l'infezione da SARS-CoV-2 dopo 12 e 24 ore.
L'analisi delle risposte immunitarie innate negli organoidi derivati dal colon infetti da SARS-CoV-2 ha mostrato che SARS-CoV-2 ha indotto una cascata di segnali pro-infiammatori nelle cellule infette mentre le cellule astanti non infette hanno mostrato una risposta immunitaria mediata dall'interferone. Inoltre, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha mostrato che le cellule infette non erano in grado di rilevare gli interferoni a causa del blocco mediato dal virus del percorso. Gli organoidi devono essere ben differenziati e sani.
Questo può essere controllato determinando il livello dei marcatori di differenziazione cellulare mediante qPCR prima dell'infezione. Se le cellule non sono ben differenziate, non supporteranno l'infezione virale e porteranno a risultati non informativi. Questa tecnica ci consente di infettare la mucosa sia dal lato luminale che da quello tissutale.
Questo è molto importante in quanto ci consente di svelare i meccanismi utilizzati dalle superfici della mucosa per tollerare un ambiente sporco da un lato e uno sterile dall'altro.
