一种三维球体模型研究肝细胞癌肿瘤-基质相互作用

3D肿瘤球体已经取代了传统的2D单层技术，成为体外癌症研究的黄金标准。这些模型允许多种细胞类型的共培养，这些细胞类型反映了肿瘤微环境的异质性，并允许利用空间相互作用。使用悬挂液滴方法生成3D球体的优点是缺乏细胞 - 塑料相互作用并且易于研究肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的相互作用。

该技术还为模拟肿瘤 - 基质相互作用提供了一种可重复且具有成本效益的方法。3D类肿瘤是有价值的临床前模型，通常用作药物筛选工具。该方法可用于研究多种化合物对肿瘤生长和周围微环境的药理作用。

球体形成过程是用户友好的，需要传统的细胞培养实验室设备。可以使用任何台式倒置光学显微镜对旋转椭球体进行成像，并且可以使用广泛使用的在线图像分析软件进行旋转椭球体大小和形状的分析。首先，从液氮中的储存架中取出Huh7和Hep3B HCC肿瘤细胞系以及COS-7和LX2成纤维细胞系并快速解冻。

解冻后，用两毫升新鲜培养基稀释解冻的细胞。离心细胞。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于一毫升新鲜温热培养基中。

然后将细胞接种在T75细胞培养瓶中，并在细胞培养箱中孵育，直到细胞达到60至70&汇合度。对于细胞收集，吸出培养基并用PBS洗涤细胞三次。然后，为了将贴壁细胞从烧瓶底部分离，加入两毫升预热的胰蛋白酶并在37摄氏度下孵育。

四分钟后，通过加入四毫升完整培养基灭活胰蛋白酶并收集细胞悬浮液，然后离心细胞并弃去上清液，然后将细胞重悬于一毫升新鲜培养基中。最后，再加入三毫升新鲜培养基。要计数细胞，轻轻涡旋细胞悬浮液。

然后使用10微升移液管，将10微升细胞悬浮液与10微升台盼蓝混合，并轻轻地上下移液混合物四次，以确保用染料完全染色外细胞表面。接下来，在血细胞计数器计数区域放置盖玻片。然后将含有细胞混合物的移液器吸头放在盖玻片的边缘旁边，并将吸头内容物轻轻地排出到计数载玻片中。

等待几分钟让浆液沉降后，将血细胞计数器固定在显微镜载物台上，并计数与顶部或右侧裁决重叠的细胞，同时避免与底部或左侧裁决重叠的细胞。最后，使用此公式计算单元格的总数。吸出培养基后，用PBS洗涤LX2细胞三次。

如前所述，使用胰蛋白酶分离细胞并离心它们。如前所述对细胞进行计数后，在10立方厘米培养皿中接种10至第六个LX2细胞，并在37摄氏度下孵育。48小时后，收集成纤维细胞调节的培养基并离心以沉淀任何漂浮的细胞。

过滤器使用连接到20毫升注射器的0.22微米过滤器对调节介质进行灭菌。然后将培养基等分到两毫升管中，以储存在零下80摄氏度。将10毫升无菌PBS添加到10立方厘米培养皿的底部，为球体提供潮湿的条件。

然后将1， 500个HuH7 HCC细胞与1， 500个COS-7哺乳动物成纤维细胞悬浮在悬挂的液滴中以形成球体。倒置培养皿的盖子，使培养基（包括细胞悬浮液）悬挂在潮湿的环境中。三天后，要拍摄球体的图像，请将培养皿放在倒置显微镜的载物台上，并将放大倍率调整为五倍。

接下来，打开所连接计算机上的显微镜软件并调整其焦点以获得每个旋转椭球体的清晰图像。然后使用显微镜软件上的捕捉工具获取图像并保存获取的图片。将10毫升无菌PBS添加到10立方厘米培养皿的底部。

然后将3， 000个Hep3B HCC细胞悬浮在悬挂的液滴中以形成球体并倒置培养皿的盖子，使液滴在潮湿的环境中悬挂三天。接下来，将Hep3B球体转移到悬挂液滴中来自LX2细胞的20微升新鲜条件培养基中。然后翻开形成球体的培养皿的盖子，并将盖子固定在光学显微镜的载物台上。

如前所述，调整显微镜的精细焦点以使每个球体可见。按下柱塞按钮小心地清空微量移液器中的空气后，将移液器吸头插入含有要转移的球体的液滴中。非常接近椭球体，而不用尖端触摸它。

接下来，轻轻释放柱塞按钮上的压力，以使球体在两微升介质中吸入微量移液器尖端。然后将球体转移到挂在新的10立方厘米盘子上的新液滴中。使用倒置显微镜以五倍放大倍率拍摄球体的图像，从转移当天到LX2条件培养基中培养的第七天。

要分析生长中的旋转椭球体的图像，请在图像分析软件中打开每个旋转体图像，并使用手绘选择工具勾勒出每个旋转椭球体的轮廓。然后从分析下拉按钮中，选择设置测量值，然后选择面积并按确定。接下来，在每个旋转椭球体周围手动绘制一个圆，一旦球体被圈出，按 Control M 以允许程序计算以像素为单位的旋转椭球体面积。然后使用此公式将旋转椭球体的面积转换为体积。

最后，计算在图像捕获的第一天，球体体积相对于其体积的变化。在优化球体形成的细胞密度期间，12， 000和6， 000个细胞的较高接种密度产生具有不对称形状的球体，而3， 000个细胞的接种密度产生完美的圆形3D球体。因此，3， 000个细胞密度球体被调整用于进一步的实验。

对共培养肿瘤和成纤维细胞系增殖影响的纵向评估表明，从第四天开始，与同型球体相比，异型球体以理想的圆形生长。异型球体最初从第四天到第七天显示出快速生长阶段，然后在第八天显示出较慢的阶段。然后，球体体积在第9天和第10天减少，可能反映了营养物质的消耗或缺氧的核心和细胞死亡。

相比之下，同型球体在第五天之前表现出相对静态的生长曲线，然后从第六天开始其生长曲线逐渐增加。异型球体的较高生长速率表明肿瘤与成纤维细胞之间的直接接触增加了肿瘤球体的大小。当在新鲜培养基中生长三天龄的同型Hep3B球状体时，细胞在三天后形成完美的圆形球体，并显示出持续增殖直到第七天。

当球体在LX2条件培养基中维持时，生长速率增强，表明成纤维细胞驱动的肿瘤球体增殖。确保将无菌BBS添加到培养皿的底部以保持合适的潮湿条件以形成球体至关重要。此外，在倒置盖子时要小心，以免球体和液滴被破坏。

3D肿瘤球体可以固定或冷冻并储存，以备将来使用，如免疫化学或免疫荧光，以及用于转录组学分析的RNA提取。可以对具有预标记细胞的异型球体进行成像和跟踪，以提供对肿瘤微环境中细胞 - 细胞相互作用的见解。