3D tümör sferoidleri in vitro kanser araştırmalarında altın standart olarak geleneksel 2D monolayer tekniğinin yerini almıştır. Bu modeller, tümör mikroçevrinin heterojenliğini yansıtan ve mekansal etkileşimlerin sömürülmesine izin veren birden fazla hücre tipinin ortak kültürüne izin verir. 3D sferoidler oluşturmak için asılı damlacık yöntemini kullanmanın avantajları, hücre-plastik etkileşiminin olmaması ve tümör hücreleri ile tümör olmayan hücreler arasındaki etkileşimi inceleme kolaylığıdır.
Bu teknik aynı zamanda tümör-stromal etkileşimi modellemek için tekrarlanabilir ve uygun maliyetli bir yol sağlar. 3D tümöroidler değerli preklinik modellerdir ve genellikle ilaç tarama aracı olarak kullanılırlar. Bu yöntem, birden fazla bileşiğin tümör büyümesi ve çevresindeki mikroçevrim üzerindeki farmakolojik etkilerini incelemek için uygulanabilir.
Küresel oluşum süreci kullanıcı dostudur ve geleneksel hücre kültürü laboratuvar ekipmanı gerektirir. Küreseller herhangi bir tezgah üstü ters ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir ve küresel boyut ve şeklin analizi yaygın olarak bulunan çevrimiçi görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Başlamak için, Huh7 ve Hep3B HCC tümör hücre hatlarını ve COS-7 ve LX2 fibroblast hücre hatlarını sıvı nitrojen içinde depolama raflarından çıkarın ve hızla çözün.
Buzları çözdükten sonra, çözülmüş hücreleri iki mililitre taze kültür ortamı ile seyreltin. Hücreleri santrifüjle. Süpernatant atın ve hücre peletini bir mililitre taze sıcak kültür ortamında yeniden atın.
Daha sonra T75 hücre kültürü şişelerindeki hücreleri tohumlayın ve hücreler 60 ila 70 ve konfluensiye ulaşana kadar bir hücre kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın. Hücre koleksiyonu için, kültür medyasını aspire edin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra yapışık hücreleri şişelerin dibinden ayırmak için iki mililitre önceden ısıtılmış tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Dört dakika sonra, dört mililitre tam kültür ortamı ekleyerek tripsin'i devre dışı bırakın ve hücre süspansiyonu toplayın, ardından hücreleri santrifüjleyin ve hücreleri bir mililitre taze kültür ortamında canlandırmadan önce süpernatantı atın. Son olarak, üç mililitrelik taze kültür ortamı ekleyin. Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonu hafifçe girdap.
Daha sonra 10 mikrolitre pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini 10 mikrolitre trypan mavisi ile karıştırın ve dış hücre yüzeyinin boya ile tamamen boyanmasını sağlamak için karışımı dört kez hafifçe pipetleyin. Ardından, hemositometre sayım alanının üzerine bir kapak yerleştirin. Ardından hücre karışımını içeren pipet ucunu kapak kapağının kenarına yerleştirin ve uç içeriğini hafifçe sayım slaydına atın.
Bulamacın oturması için birkaç dakika bekledikten sonra, mikroskop aşamasında hemositometreyi sabitleyin ve alt veya sol kararla çakışanlardan kaçınırken üst veya sağ kararla örtüşen hücreleri sayın. Son olarak, bu formülü kullanarak toplam hücre sayısını hesaplayın. Kültür ortamını aspire ettikten sonra, LX2 hücrelerini PBS ile üç kez yıkayın.
Hücreleri daha önce gösterildiği gibi tripsin kullanarak ayırın ve santrifüj edin. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi saydıktan sonra, 10 santimetreküp tabaktaki altıncı LX2 hücrelerine bir kez 10 kez tohumlayın ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, fibroblast şartlandırılmış ortamı toplayın ve yüzen hücreleri peletmek için santrifüj.
Filtre, 20 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 0,22 mikron filtre kullanarak şartlandırılmış ortamı sterilize eder. Sonra medyayı eksi 80 santigrat derecede depolamak için iki mililitre tüpe ayırın. Küreseller için nemli koşullar sağlamak için 10 santimetreküp bir kabın dibine 10 mililitre steril PBS ekleyin.
Daha sonra küre oluşturmak için asılı damlacıklarda 1.500 COS-7 memeli fibroblast hücresi ile 1.500 HuH7 HCC hücresini askıya alın. Hücre süspansiyonu da dahil olmak üzere ortamın nemli bir ortama sarkmasını sağlamak için kabın kapağını ters çevirin. Üç gün sonra, küresellerin görüntülerini çekmek için, tabağı ters bir mikroskop sahnesine koyun ve büyütmeyi beş kez ayarlayın.
Ardından, ekli bilgisayardaki mikroskop yazılımını açın ve odağını her küreselin net bir görüntüsüne sahip olacak şekilde ayarlayın. Ardından, görüntüleri elde etmek ve elde edilen resimleri kaydetmek için mikroskop yazılımındaki yakalama aracını kullanın. 10 santimetreküp kabın altına 10 mililitre steril PBS ekleyin.
Daha sonra asılı damlacıklardaki 3.000 Hep3B HCC hücresini küre oluşturmak için askıya alın ve damlacıkların üç gün boyunca nemli bir ortama sarkmasını sağlayan kabın kapağını ters çevirin. Daha sonra, Hep3B küresellerini asılı damlacıklardaki LX2 hücrelerinden 20 mikrolitre taze durum ortamına aktarın. Daha sonra küresellerin oluştuğu kabın kapağını ters çevirin ve kapağı hafif bir mikroskop aşamasına sabitlayın.
Her bir küreseli daha önce gösterildiği gibi görünür hale getirmek için mikroskobun ince odağını ayarlayın. Mikropipetten havayı dikkatlice boşaltmak için piston düğmesine bastıktan sonra, pipet ucunu aktarılacak küreseli içeren damlacığın içine yerleştirin. Ucuyla dokunmadan küresele çok yaklaşın.
Daha sonra, küreselin mikropipette ucuna iki mikrolitrelik ortamda emilmesini sağlamak için piston düğmesindeki basıncı hafifçe bırakın. Daha sonra küreseli yeni bir 10 santimetreküp kabın üzerinde asılı yeni bir damlacık içine aktarın. LX2 şartlandırılmış ortamda, transfer gününden yedinci kültür gününe kadar ters bir mikroskop kullanarak beş kat büyütmede küresellerin görüntülerini alın.
Büyüyen küresellerin görüntülerini analiz etmek için, her bir küresel görüntüyü bir görüntü analizi yazılımında açın ve her bir küreseli ana hatlarıyla belirlemek için serbest seçim aracını kullanın. Ardından analiz açılır düğmesinden ölçü ayarla'yı seçin ve ardından alan ve Tamam'a basın. Ardından, her bir küreselin etrafına manuel olarak bir daire çizin ve küre daire içine alındıktan sonra, programın küresel alanı piksel cinsinden hesaplamasına izin vermek için Kontrol M tuşuna basın. Daha sonra bu formülü kullanarak küresel alanı bir birime dönüştürün.
Son olarak, görüntü yakalamanın ilk gününde hacmine göre küresel hacimdeki değişimi hesaplayın. Küresel oluşum için hücre yoğunluğunun optimizasyonu sırasında, 12. Böylece, 3.000 hücre yoğunluğu sferoidi daha fazla deney için uyarlanmıştır.
Birlikte kült olan tümör ve fibroblast hücre çizgilerinden kaynaklanan proliferatif etkinin uzunlamasına değerlendirilmesi, dördüncü günden itibaren heterotipik sferoidlerin homotipik sferoidlere kıyasla ideal yuvarlak benzeri bir şekilde büyüdüğünü göstermiştir. Heterotipik küreseller başlangıçta dördüncü günden yedinci güne kadar hızlı bir büyüme evresi ve ardından sekizinci günde daha yavaş bir evre gösterdi. Küresel hacim daha sonra dokuz ve 10 gün içinde azaldı, muhtemelen besinlerin tükenmesini veya hipoksik bir çekirdek ve hücre ölümünü yansıttı.
Buna karşılık, homotipik küreseller beşinci güne kadar nispeten statik bir büyüme eğrisi sergilediler ve ardından altıncı günden itibaren büyüme eğrilerinde kademeli bir artış oldu. Heterotipik sferoidlerin daha yüksek büyüme hızı, tümör ve fibroblastlar arasındaki doğrudan temasın tümör sferoidlerinin boyutunu artırdığını göstermektedir. Taze medyada üç günlük homotipik Hep3B sferoidler yetiştirildiğinde, hücreler üç gün sonra mükemmel yuvarlatılmış küreseller oluşturdu ve yedinci güne kadar çoğalma devam etti.
LX2 şartlandırılmış medyada sferoidler korunduğunda büyüme hızı artmış, bu da tümör sferoidlerinin fibroblast güdümlü çoğalmasını düşündürmektedir. Küresel oluşum için uygun nemli durumu korumak için steril BBS'nin bulaşıkların dibine ekli olduğundan emin olmak çok önemlidir. Ayrıca, sferoidlerin ve damlacıkların bozulmaması için kapağı ters çevirirken dikkatli olun.
3D tümör sferoidleri sabitlenebilir veya dondurulabilir ve immünokimya veya immünofluoresans gibi gelecekteki uygulamalar için saklanabilir ve transkriptomik analiz için RNA ekstraksiyonu yapılabilir. Önceden etiketlenmiş hücrelere sahip heterotipik küreseller, tümör mikroçevresi içindeki hücre-hücre etkileşimleri hakkında fikir vermek için görüntülenebilir ve izlenebilir.
