Os esferoides tumorais 3D substituíram a técnica convencional de monocamada 2D como padrão ouro para a pesquisa de câncer in vitro. Esses modelos permitem a cocultura de múltiplos tipos celulares que refletem a heterogeneidade do microambiente tumoral e permitem a exploração de interações espaciais. As vantagens de usar o método de gotículas penduradas para gerar esferoides 3D é a falta de interação celular-plástico e a facilidade de estudar a interação entre as células tumorais e as células não tumorais.
Esta técnica também fornece uma maneira reprodutível e econômica de modelar a interação tumoral-estromal. Tumoróides 3D são modelos pré-clínicos valiosos e são frequentemente usados como uma ferramenta de triagem de drogas. Este método pode ser aplicado para estudar os efeitos farmacológicos de múltiplos compostos sobre o crescimento do tumor e o microambiente circundante.
O processo de formação de esferoides é fácil de usar e requer equipamentos convencionais de laboratório de cultura celular. Os spheroids podem ser imagens usando qualquer microscópio de luz invertido de bancada, e a análise do tamanho e forma de spheroid pode ser realizada usando um software de análise de imagem on-line amplamente disponível. Para começar, remova as linhas de células tumorais Hein7 e Hep3B HCC e as linhas celulares fibroblasto COS-7 e LX2 de seu rack de armazenamento em nitrogênio líquido e descongele-as rapidamente.
Após descongelar, dilui as células descongeladas com dois mililitros de meio de cultura fresca. Centrifugar as células. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em um mililitro de meio de cultura quente fresco.
Em seguida, semear as células em frascos de cultura celular T75 e incuba-las em uma incubadora de cultura celular até que as células atinjam 60 a 70&confluência. Para coleta celular, aspire os meios de cultura e lave as células três vezes com PBS. Em seguida, para separar as células aderentes do fundo dos frascos, adicione dois mililitros de trippsina pré-aquecida e incubar a 37 graus Celsius.
Após quatro minutos, inative a trippsina adicionando quatro mililitros de meio de cultura completa e colete a suspensão celular, em seguida, centrifugar as células e descartar o supernatante antes de reutilizar as células em um mililitro de meio de cultura fresca. Finalmente, adicione mais três mililitros de meio de cultura fresca. Para contar as células, bata suavemente a suspensão celular.
Em seguida, usando uma pipeta de 10 microliteres, misture 10 microliters da suspensão celular com 10 microliters de azul tripla e pipeta suavemente a mistura para cima e para baixo quatro vezes para garantir a coloração completa da superfície da célula externa com o corante. Em seguida, coloque uma mancha de cobertura sobre a área de contagem do hemótmetro. Em seguida, coloque a ponta da pipeta contendo a mistura celular ao lado da borda do deslizamento e expulse suavemente o conteúdo da ponta no slide de contagem.
Depois de esperar alguns minutos para que o chorume se instale, fixe o hemócito no estágio do microscópio e conte as células sobrepostas à decisão superior ou direita, evitando aquelas sobreposições da parte inferior ou da decisão esquerda. Finalmente, calcule o número total de células usando esta fórmula. Depois de aspirar o meio de cultura, lave as células LX2 três vezes com PBS.
Desprender as células usando trippsina como demonstrado anteriormente e centrifuá-las. Depois de contar as células como demonstrado anteriormente, sementes uma vez 10 a sexta células LX2 em pratos de 10 centímetros cúbicos e incubar a 37 graus Celsius. Após 48 horas, colete o meio e a centrífuga condicionada ao fibroblasto para doar qualquer célula flutuante.
O filtro esteriliza o meio condicionado usando um filtro de 0,22 mícron ligado a uma seringa de 20 mililitros. Em seguida, aliquot a mídia em dois tubos mililitros para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Adicione 10 mililitros de PBS estéreis ao fundo de um prato de 10 centímetros cúbicos para fornecer condições úmidas para os esferoides.
Em seguida, suspenda 1.500 células HuH7 HCC com 1.500 células fibroblastos de mamíferos COS-7 em gotículas penduradas para formar esferas. Inverta a tampa do prato para permitir que a mídia, incluindo a suspensão celular, paire sobre um ambiente úmido. Após três dias, para tirar imagens dos esferoides, coloque o prato no palco de um microscópio invertido e ajuste a ampliação para cinco vezes.
Em seguida, abra o software de microscópio no computador conectado e ajuste seu foco para ter uma imagem clara de cada esferoide. Em seguida, use a ferramenta snap no software de microscópio para adquirir as imagens e salvar as imagens adquiridas. Adicione 10 mililitros de PBS estéreis ao fundo de um prato de 10 centímetros cúbicos.
Em seguida, suspenda 3.000 células Hep3B HCC nas gotículas penduradas para formar esferas e inverter a tampa do prato permitindo que as gotículas pairem sobre um ambiente úmido por três dias. Em seguida, transfira os esferoides Hep3B para 20 microliters de mídia de condição fresca de células LX2 em gotículas penduradas. Em seguida, inverta a tampa do prato em que os esferoides são formados e fixe a tampa no estágio de um microscópio leve.
Ajuste o foco fino do microscópio para tornar cada esferoide visível como demonstrado anteriormente. Depois de pressionar o botão do êmbolo para esvaziar cuidadosamente o ar da micropipette, insira a ponta pipeta na gota contendo o esferoide a ser transferido. Aproxime-se muito do esferoide sem tocá-lo com a ponta.
Em seguida, solte suavemente a pressão no botão do êmbolo para permitir a sucção do esferoide na ponta da micropipette em dois microliters de mídia. Em seguida, transfira o esferoide para uma nova gota pendurada em um novo prato de 10 centímetros cúbicos. Faça imagens dos esferoides em cinco vezes a ampliação usando um microscópio invertido desde o dia da transferência até o sétimo dia de cultura na mídia condicionada LX2.
Para analisar as imagens dos esferoides em crescimento, abra cada imagem esferoide em um software de análise de imagem e use a ferramenta de seleção à mão livre para delinear cada esferoide. Em seguida, a partir do botão de dropdown de análise, selecione a medição do conjunto, seguido por área e pressione OK. Em seguida, desenhe manualmente um círculo em torno de cada esferoide e, uma vez que a esfera é circulada, pressione o Controle M para permitir que o programa calcule a área esferoide em pixels. Em seguida, converta a área do esferoide em um volume usando esta fórmula.
Finalmente, calcule a alteração no volume de spheroid em relação ao seu volume no primeiro dia de captura de imagem. Durante a otimização da densidade celular para formação esferoide, maiores densidades de semeadura de 12.000 e 6.000 células produziram esferoides com uma forma assimétrica, enquanto uma densidade de semeadura de 3.000 células deu um esferoide 3D arredondado perfeito. Assim, 3.000 esferoides de densidade celular foram adaptados para outros experimentos.
A avaliação longitudinal do impacto proliferativo das linhas de células tumorais e fibroblastos mostrou que, a partir do quarto dia, os esferoides heterotípicos cresceram em uma forma redonda ideal em comparação com os esferoides homotípicos. Os esferoides heterotípicos inicialmente mostraram uma fase de crescimento rápido a partir do quarto ao sétimo dia, seguido por uma fase mais lenta no oitavo dia. O volume esferoide diminuiu nos dias nove e 10, possivelmente refletindo o esgotamento de nutrientes ou um núcleo hipóxico e morte celular.
Em contraste, os esferoides homotípicos apresentaram uma curva de crescimento relativamente estática até o quinto dia, seguido por um aumento gradual em suas curvas de crescimento a partir do sexto dia. A maior taxa de crescimento de esferoides heterotípicos sugere que o contato direto entre tumor e fibroblastos aumenta o tamanho dos esferoides tumorais. Quando os esferoides hep3B homotípicos de três dias de idade foram cultivados em mídia fresca, as células formaram esferoides perfeitamente arredondados após três dias e mostraram proliferação contínua até o sétimo dia.
A taxa de crescimento foi aprimorada quando os esferoides foram mantidos em mídia condicionada lx2, sugerindo uma proliferação impulsionada por fibroblasto de esferoides tumorais. É crucial garantir que o BBS estéril seja adicionado ao fundo dos pratos para manter a condição úmida adequada para a formação de esferoides. Além disso, tenha cuidado ao inverter a tampa para que os esferoides e as gotículas não sejam interrompidos.
Os esferoides tumorais 3D podem ser corrigidos ou congelados e armazenados para aplicações futuras, como imunoquímica ou imunofluorescência, bem como extração de RNA para análise transcriômica. Esferoides heterotípicos com células pré-rotuladas podem ser imagens e rastreados para fornecer insights sobre as interações célula-células dentro do microambiente tumoral.
