Bu yöntem, florojenik bir prob kullanarak in vitro olarak organoid olarak yetiştirilen canlı birincil hücrelerdeki hücresel ROS seviyelerini değerlendirmek için hücresel biyoloji alanında değerli bir araçtır. Bu tekniğin temel avantajı, ROS'un sağlam bağırsak organoidlerinde mikroskopi ile nitel olarak görselleştirilebilmesi ve 96 kuyu plakası kullanılarak akış sitometrisi ile ayrışmış hücrelerde nicel olarak analiz edilebilmesidir. Bu yöntem diğer organoid modellerine uygulanabilir ve farklı hücresel yolları analiz etmek için alternatif floresan sensörler kullanılabilir.
Bu protokolü ilk kez uygulamadan önce, deneyci organoid kültürüne aşina olmalı ve geçmelidir. Protokolümüz tarama yaklaşımlarına iyi adapte olmasına rağmen, yeni başlayanlar birkaç örnekle başlamalıdır. Prosedürü gösteren sophie Dulauroy, laboratuvardan bir mühendis.
8 ila 10 haftalık bir Lgr5-GFP faresini feda ettikten sonra, duodenum ve ileum arasındaki jejunum kuşatıcı bölgenin beş ila sekiz santimetresini toplayın ve buz üzerinde antibiyotiklerle desteklenmiş soğuk DPBS'ye yerleştirin. Daha sonra, antibiyotik içeren beş ila 10 mililitre soğuk DPBS ile yıkanarak bağırsak içeriğini temizleyin. Daha sonra top ucu makası kullanarak, bağırsağı uzunlamasına açın ve uzunlamasına kullanarak, dokuyu antibiyotiklerle soğuk DPBS içeren bir Petri kabına aktarın.
Durulamak için kabın içindeki dokuyu sallayın. Daha sonra, plastik bir Pasteur pipet kullanarak bağırsağı aspirasyonla tutun ve 10 mililitre soğuk 10 milimolar EDTA içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü üç kez ters çevirin ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, dokuyu 10 mililitre DPBS ve girdap içeren bir tüpe iki dakika aktarın. Hemen bir Petri kabına fraksiyonun 10 mikrolitresini ekleyin ve fraksiyonun kalitesini değerlendirmek için bir mikroskop kullanın. DPBS'de her transfer arasında iki dakikalık girdap bulunan tüpler içeren iki transferden sonra, daha önce gösterildiği gibi EDTA'daki bağırsağı buz üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırın.
Her transfer arasında üç dakikalık girdap bulunan DPBS içeren tüplerde art arda yapılan üç transferin ardından, seçilen tüpleri üç kez ters çevirerek ve 70 mikron hücreli süzgeçten süzerek en iyi fraksiyonları 50 mililitrelik bir tüpte birleştirin. Ardından, beş mililitre soğuk DMEM F12 eklemeden önce mahzenleri döndürün, süpernatantı atın ve peletin mekanik olarak bozulsun. Mikroskop altında manuel olarak 10 mikroliter aliquot'ta bulunan mahzen sayısını sayın.
Saydıktan sonra, mahzenleri tekrar döndürün ve üst saltantları dikkatlice çıkarın. Daha sonra peletin mekanik olarak bozulması ve mikroliter başına 90 mahzen konsantrasyonu elde etmek için tüpe büyüme kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra, mikroliter başına 30 mahzenin son konsantrasyonunu elde etmek için iki hacim sulandırılmamış bodrum membran matrisi veya BMM ekleyin ve hava kabarcıklarını karışıma sokmadan süspansiyonu dikkatlice yukarı ve aşağı borulayın.
Akış sitometri analizi için, bmm mahzenlerinin plaka 10 mikrolitresi önceden ısıtılmış yuvarlak alt 96 kuyu plakasının her kuyusunun merkezinde bir kubbe olarak karıştırın. Ve görüntüleme için, karışımın 10 mikrolitresini önceden ısıtılmış bir mikroslid sekiz kuyulu haznede ince bir tabaka olarak biriktirin. BMM'nin oda sıcaklığında beş dakika katılaşmasını sağladıktan sonra, plakaları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin.
15 dakika sonra, BMM'yi ayırmamaya dikkat ederek her kuyuya 250 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre yerleştirin. Konfokal mikroskopi ile oksidatif stresi görselleştirmek için, organoidlerle kaplanmış sekiz kuyulu mikroslid sekiz kuyulu odanın ilgili kuyularına bir mikroliter n-asetilsistein stok çözeltisi ekleyin. Bir saatlik bir inkübasyondan sonra, ilgili kuyulara bir mikroliter tert-butil hidroperoksit stok çözeltisi ekleyin ve 30 dakika daha kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, kuyu başına florojenik probun 1,25 milimolar seyreltilmesinden bir mikrolitre ve ardından mililitre Hoechst çözeltisi başına 1,25 miligramlık bir mikrolitre ekleyin. 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın ve fenol kırmızısı olmadan 250 mikrolitre sıcak DMEM ekleyin. Organoidleri, florojenik probu algılayan bir terik odası ve gaz kaynağı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.
Pozitif kontrolü kullanarak, ROS sinyali için lazer yoğunluğunu ve zamana maruz kalmayı ayarlayın ve bu sinyalin negatif kontrolde daha düşük olup olmadığını kontrol edin. Ardından, bir göz merceği kullanarak, GFP'yi ifade eden organoidleri tanımlamak ve lazer yoğunluğunu ayarlamak için slaytı tarayın. 25 mikrometreden oluşan bir z yığını kurun ve organoidlerin bir hücre tabakasını gösteren bir bölümünü elde etmek için tüm organoidin dikişli bir görüntüsünü elde etmek için pozisyonlar tanımlayın.
Organoidleri içeren 96 kuyulu yuvarlak alt plakanın negatif kontrol kuyularına n-asetilsistein stok çözeltisinin bir mikroliterini ekleyin. Bir saatlik bir inkübasyondan sonra, ilgili kuyulara bir mikroliter tert-butil hidroperoksit stok çözeltisi ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, bağlı BMM'yi rahatsız etmeden ortamı çıkarın ve başka bir 96 kuyu yuvarlak alt plakaya aktarın.
Bu tabağı bir kenara bırak. Daha sonra, 100 mikrolitre tripsin ekleyin ve çok kanallı bir pipet kullanarak, BMM'yi yok etmek için beş kez pipet yukarı ve aşağı. Beş dakikalık kısa bir inkübasyondan sonra, organoidleri ikinci kez yukarı ve aşağı pipetleyarak ayrıştırın.
Plakayı döndürün ve plakayı ters çevirerek süpernatant atın. Daha önce başka bir 96 kuyu plakasında toplanan ortamı ilgili kuyulara geri ekleyin ve hücreleri beş kez yukarı ve aşağı pipetleyarak yeniden biriktirin. Daha sonra, florojenik probun bir mikroliterini ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra plakayı tekrar döndürün ve hücreleri 250 mikrolitre DAPI çözeltisi ile yeniden kullanın. Örnekleri akış sitometri tüplerine aktarın ve tüpleri buzda tutun. Tekli numuneler kullanarak her florofor için ellenmemiş kontrol ve lazer voltajlarında ileri ve yan dağılım gerilimi ayarlarını optimize edin.
Ardından uygun bir gating stratejisi kullanarak en az 20.000 olay toplayın. ROS boyama ve organoidlerin temsili konfokal görüntüleri, NAC inhibitörünün varlığında, sadece organoidin lümeninde bulunan ölü hücrelerden gelen sinyalin görülebildiğine göstermiştir. Tedavi edilmeyen organoidde bazal ROS seviyeleri, özellikle GFP pozitif hücrelerinde görülebilir ve kök hücrelerin farklılaştırılmış hücrelerden daha yüksek ROS ürettiğini kanıtlayabilir.
GFP pozitif hücreler florojenik prob varlığında indükleyici ile daha önemli bir sitoplazmik sinyal sunarak ros seviyelerinin özellikle tedavi sonrası kök hücrelerde arttığını gösterir. Bağırsak organoidlerinde ROS üretiminin akış sitometrisi analizi, bazal ROS seviyelerinin inhibitör ile stimülasyondan sonra azaldığını ve indükleyici ile meydan okumadan sonra arttığını göstermektedir. inhibitör ile önceden tedavi edilen ve daha sonra indükleyici ile uyarılan hücreler, sadece indükleyici ile uyarılanlardan daha düşük seviyeler sunar.
GFP pozitif olarak kapılı kök hücreler üzerinde yapılan benzer bir analiz, inhibitör tedavisi üzerine ROS seviyesinde 3,5 kat azalma ve uyarılmamış hücreler üzerinde indükleyici tedavide dört kat artış göstermektedir. Bu prosedürü denerken, kullanıcılar organoid manipülasyonu ve ayrışması sırasında hücre stresini sınırlamayı unutmamalıdır. Ayrıca, ROS analiz ederken her zaman olumlu ve olumsuz kontroller dahil edilmelidir.
Bu prosedürden sonra, ros regülasyonu hakkında ek bilgiler elde etmek için sabit bozulmamış organoidlerde immünofluoresans lekeleme, hücre sıralama ve gen ekspresyon analizi ile analiz tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, murine bağırsak organoidlerini nasıl yetiştireceğinizi, sağlam organoidlerin canlı görüntüleme analizini nasıl gerçekleştireceğinizi ve akış sitometri analizi için bağırsak organlarını nasıl işleyeceğinizi bilmelisiniz.
