Diese Methode ist ein wertvolles Werkzeug auf dem Gebiet der Zellbiologie zur Beurteilung zellulärer ROS-Spiegel in lebenden Primärzellen, die in vitro als Organoide mit einer fluorogenen Sonde kultiviert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ROS in intakten Darmorganoiden durch Mikroskopie qualitativ visualisiert und in dissoziierten Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von 96-Well-Platten quantitativ analysiert werden kann. Diese Methode kann auf andere Organoidmodelle angewendet werden und alternative Fluoreszenzsensoren könnten verwendet werden, um verschiedene zelluläre Signalwege zu analysieren.
Bevor er dieses Protokoll zum ersten Mal anwendet, sollte sich der Experimentator mit der Organoidkultur und dem Passaging vertraut machen. Obwohl unser Protokoll gut an Screening-Ansätze angepasst ist, sollten Anfänger mit ein paar Proben beginnen. Das Verfahren wird Sophie Dulauroy, eine Ingenieurin aus dem Labor, demonstrieren.
Nachdem Sie eine 8 bis 10 Wochen alte Lgr5-GFP-Maus geopfert haben, sammeln Sie fünf bis acht Zentimeter des Jejunums, das die Region zwischen Zwölffingerdarm und Ileum umfasst, und legen Sie es in kaltes DPBS, das mit Antibiotika auf Eis ergänzt wird. Als nächstes reinigen Sie den Darminhalt, indem Sie mit fünf bis 10 Millilitern kaltem DPBS, das Antibiotika enthält, spülen. Öffnen Sie dann mit einer Kugelspitzenschere den Darm längs und übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine Petrischale, die kaltes DPBS mit Antibiotika enthält.
Schütteln Sie das Gewebe in der Schale, um es zu spülen. Als nächstes greifen Sie den Darm durch Aspiration mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und übertragen Sie ihn in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter kaltes 10-Millimolar-EDTA enthält. Drehen Sie die Röhre dreimal um und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.
Nach der Inkubation wird das Gewebe für zwei Minuten in ein Röhrchen mit 10 Millilitern DPBS und Wirbel übertragen. Fügen Sie sofort 10 Mikroliter der Fraktion in eine Petrischale hinzu und verwenden Sie ein Mikroskop, um die Qualität der Fraktion zu beurteilen. Nach zwei Transfers in DPBS-haltigen Röhrchen mit zweiminütigen Wirbeln zwischen jedem Transfer, inkubieren Sie den Darm in EDTA auf Eis für fünf Minuten, wie zuvor gezeigt.
Nach drei aufeinanderfolgenden Transfers in DPBS-haltigen Röhrchen mit dreiminütiger Wirbelung zwischen jedem Transfer werden die besten Fraktionen zu einem 50-Milliliter-Röhrchen kombiniert, indem die ausgewählten Röhrchen dreimal invertiert und durch ein 70-Mikron-Zellsieb filtriert werden. Dann drehen Sie die Krypten, verwerfen Sie den Überstand und zerbrechen Sie das Pellet mechanisch, bevor Sie fünf Milliliter kaltes DMEM F12 hinzufügen. Zählen Sie die Anzahl der in einem 10-Mikroliter-Aliquot vorhandenen Krypten manuell unter einem Mikroskop.
Nach dem Zählen drehen Sie die Krypten erneut und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann das Pellet mechanisch aufbrechen und dem Röhrchen Wachstumskulturmedium hinzufügen, um eine Konzentration von 90 Krypten pro Mikroliter zu erhalten. Als nächstes fügen Sie zwei Volumen unverdünnter Kellermembranmatrix oder BMM hinzu, um eine endgültige Konzentration von 30 Krypten pro Mikroliter zu erhalten, und pipettieren Sie die Suspension vorsichtig auf und ab, ohne Luftblasen in die Mischung einzuführen.
Für die Durchflusszytometrie-Analyse mischen sich Platte 10 Mikroliter der Krypten BMM als Kuppel in der Mitte jedes Bohrlochs einer vorgewärmten runden unteren 96-Well-Platte. Und für die Bildgebung 10 Mikroliter der Mischung als dünne Schicht in einer vorgewärmten Mikrorutschen-Acht-Wellen-Kammer abscheiden. Nachdem sie das BMM fünf Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren lassen, legen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einen Inkubator.
Nach 15 Minuten fügen Sie 250 Mikroliter Wachstumsmedium in jede Vertiefung hinzu, achten Sie darauf, das BMM nicht zu lösen, und legen Sie die Platte in den Inkubator. Um oxidativen Stress durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen, fügen Sie einen Mikroliter n-Acetylcystein-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen der mit Organoiden plattierten Mikrorutsche-Acht-Well-Kammer hinzu. Nach einer einstündigen Inkubation einen Mikroliter tert-Butylhydroperoxid-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben und weitere 30 Minuten inkubieren.
Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter der 1,25 Millimol-Verdünnung der fluorogenen Sonde pro Vertiefung hinzu, gefolgt von einem Mikroliter von 1,25 Milligramm pro Milliliter Hoechst-Lösung. Nach einer weiteren 30-minütigen Inkubation entfernen Sie das Medium, ohne das BMM zu stören, und fügen Sie vorsichtig 250 Mikroliter warmes DMEM ohne Phenolrot hinzu. Stellen Sie die Organoide mit einem konfokalen Mikroskop vor, das mit einer Thermischen Kammer und einer Gasversorgung ausgestattet ist, die die fluorogene Sonde erkennt.
Stellen Sie mit der Positivkontrolle die Laserintensität und die Zeitbelichtung für das ROS-Signal ein und überprüfen Sie, ob dieses Signal in der Negativkontrolle niedriger ist. Als nächstes screenen Sie den Objektträger mit einem Okular, um die Organoide zu identifizieren, die GFP ausdrücken, und passen Sie die Laserintensität an. Richten Sie einen Z-Stapel von 25 Mikrometern ein und definieren Sie Positionen, um ein zusammengefügtes Bild des gesamten Organoids zu erhalten, um einen Abschnitt der Organoide zu erhalten, der eine Zellschicht zeigt.
Fügen Sie einen Mikroliter der n-Acetylcystein-Stammlösung in die Negativkontrolltöpfe der runden 96-Well-Bodenplatte mit den Organoiden hinzu. Nach einer einstündigen Inkubation einen Mikroliter tert-Butylhydroperoxid-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben und 30 Minuten inkubieren. Entfernen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette das Medium, ohne das angebrachte BMM zu stören, und übertragen Sie es auf eine weitere runde 96-Well-Bodenplatte.
Halten Sie diesen Teller beiseite. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Trypsin hinzu und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um das BMM zu zerstören. Dissoziieren Sie nach einer kurzen fünfminütigen Inkubation die Organoide, indem Sie ein zweites Mal auf und ab pipettieren.
Drehen Sie die Platte und verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Platte umkehren. Fügen Sie das zuvor in einer anderen 96-Well-Platte gesammelte Medium wieder in die entsprechenden Wells hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie fünfmal nach oben und unten pipettieren. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter der fluorogenen Sonde hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten.
Dann drehen Sie die Platte erneut und resuspendieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern DAPI-Lösung. Übertragen Sie die Proben in Durchflusszytometrieröhrchen und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Optimieren Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungseinstellungen für nicht gebeizte Steuer- und Laserspannungen für jeden Fluorophor mit monogefärbten Proben.
Sammeln Sie dann mit einer geeigneten Gating-Strategie mindestens 20.000 Ereignisse. Repräsentative konfokale Bilder von ROS-Färbung und Organoiden zeigten, dass in Gegenwart des NAC-Inhibitors nur das Signal der toten Zellen sichtbar ist, die im Lumen des Organoids enthalten sind. Im unbehandelten Organoid sind die basalen ROS-Spiegel zu sehen, insbesondere in GFP-positiven Zellen, was beweist, dass Stammzellen eine höhere ROS produzieren als differenzierte Zellen.
GFP-positive Zellen präsentieren in Gegenwart der fluorogenen Sonde ein signifikanteres zytoplasmatisches Signal mit dem Induktor, was zeigt, dass die ROS-Spiegel insbesondere in Stammzellen nach der Behandlung ansteigen. Die durchflusszytometrische Analyse der ROS-Produktion in den Darmorganoiden zeigt, dass die basalen ROS-Spiegel nach Stimulation mit Inhibitor abnehmen und nach Herausforderung mit Induktor ansteigen. Zellen, die mit Inhibitor vorbehandelt und dann mit Induktor stimuliert werden, weisen niedrigere Spiegel auf als diejenigen, die mit Induktor allein stimuliert werden.
Eine ähnliche Analyse an Stammzellen, die als GFP-positiv abgegrenzt wurden, zeigt eine 3,5-fache Abnahme des ROS-Spiegels bei Inhibitorbehandlung und eine vierfache Zunahme bei Induktorbehandlung gegenüber nicht stimulierten Zellen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, sollten Benutzer daran denken, den Zellstress während der Organoidmanipulation und Dissoziation zu begrenzen. Darüber hinaus sollten Bei der Analyse von ROS immer Positiv- und Negativkontrollen einbezogen werden.
Nach diesem Verfahren kann die Analyse durch Immunfluoreszenzfärbung auf festen intakten Organoiden, Zellsortierung und Genexpressionsanalyse ergänzt werden, um zusätzliche Einblicke in die ROS-Regulation zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie Sie murine Darmorganoide züchten, Live-Imaging-Analysen intakter Organoide durchführen und Darmorgane für die Durchflusszytometrie-Analyse verarbeiten.
