Этот метод является ценным инструментом в области клеточной биологии для оценки клеточных уровней АФК в живых первичных клетках, культивируемых in vitro в качестве органоидов с использованием фторогенного зонда. Основным преимуществом данной методики является то, что АФК можно качественно визуализировать в интактных органоидах кишечника с помощью микроскопии и количественно проанализировать в диссоциированных клетках методом проточной цитометрии с использованием 96-луночных пластин. Этот метод может быть применен к другим органоидным моделям, а альтернативные флуоресцентные датчики могут быть использованы для анализа различных клеточных путей.
Прежде чем применять этот протокол в первый раз, экспериментатор должен ознакомиться с органоидной культурой и пассажем. Хотя наш протокол хорошо адаптирован к подходам к скринингу, новичкам следует начать с нескольких образцов. Продемонстрировать процедуру продемонстрирует Софи Дюлоруа, инженер из лаборатории.
Пожертвовав 8-10-недельной мышью Lgr5-GFP, соберите от пяти до восьми сантиметров тощей кишки, охватывающей область между двенадцатиперстной кишкой и подвздошной кишкой, и поместите ее в холодный DPBS, дополненный антибиотиками на льду. Затем очистите кишечное содержимое, промыв пять-10 миллилитров холодных DPBS, содержащих антибиотики. Затем с помощью шариковых ножниц открыть кишечник продольно и с помощью щипцов перенести ткань в чашку Петри, содержащую холодные DPBS с антибиотиками.
Встряхните ткань внутри блюда, чтобы промыть его. Затем захватите кишечник путем аспирации с помощью пластиковой пипетки Пастера и перенесите ее в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров холодной 10-миллимолярной ЭДТА. Переверните трубку три раза и высиживайте ее на льду в течение 10 минут.
После инкубации переложите ткань в пробирку, содержащую 10 миллилитров DPBS и вихрь в течение двух минут. Сразу же добавьте 10 микролитров фракции в чашку Петри и используйте микроскоп для оценки качества фракции. После двух переносов в DPBS, содержащих трубки с двухминутным вихрем между каждым переносом, инкубируйте кишечник в ЭДТА на льду в течение пяти минут, как было показано ранее.
После трех последовательных переносов в трубках, содержащих DPBS с трехминутным вихрем между каждым переносом, объедините лучшие фракции в 50-миллилитровую трубку, трижды инвертируя выбранные трубки и фильтруя через 70-микронный клеточный сетчатый фильтр. Затем раскрутите крипты, выбросьте супернатант и механически разрушите гранулу, прежде чем добавить пять миллилитров холодного DMEM F12. Подсчитайте количество крипт, присутствующих в 10-микролитровой аликвоте, вручную под микроскопом.
После подсчета снова раскрутите склепы и аккуратно удалите супернатант. Затем механически разрушают гранулу и добавляют в трубку культуральную среду для роста, чтобы получить концентрацию 90 крипт на микролитр. Затем добавьте два объема неразбавленной матрицы базальной мембраны или BMM, чтобы получить конечную концентрацию 30 крипт на микролитр и аккуратно пипеткой суспензию вверх и вниз, не вводя пузырьки воздуха в смесь.
Для анализа проточной цитометрии пластину 10 микролитров криптЫ BMM смешивают в качестве купола в центре каждой скважины предварительно нагретой круглодонной 96-луночной пластины. А для визуализации нанесите 10 микролитров смеси тонким слоем в предварительно нагретую восьмилуночную камеру микрополощи. Дав BMM затвердеть при комнатной температуре в течение пяти минут, поместите пластины в инкубатор при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа.
Через 15 минут добавьте в каждую лунку по 250 микролитров питательной среды, следя за тем, чтобы не отсоединить БММ, и поместите пластину в инкубатор. Для визуализации окислительного стресса с помощью конфокальной микроскопии добавляют один микролитр раствора n-ацетилцистеина в соответствующие скважины микрослайдной восьмилуночной камеры, покрытой органоидами. После часовой инкубации добавляют один микролитр раствора трет-бутилгидропероксида в соответствующие лунки и инкубируют еще 30 минут.
Далее добавляют один микролитр 1,25-миллимолярного разведения фторогенного зонда на лунку, а затем один микролитр 1,25 миллиграмма на миллилитр раствора Хохста. После еще одной 30-минутной инкубации удалите среду, не нарушая BMM, и осторожно добавьте 250 микролитров теплого DMEM без фенолового красного цвета. Визуализируйте органоиды с помощью конфокального микроскопа, оснащенного термической камерой и газоснабжением, который обнаруживает флюорогенный зонд.
Используя положительный контроль, настройте интенсивность лазера и временную экспозицию для сигнала ROS и проверьте, что этот сигнал ниже в отрицательном контроле. Затем, используя окуляр, экранируйте слайд, чтобы идентифицировать органоиды, экспрессирующие GFP, и отрегулировать интенсивность лазера. Настройте z-стек из 25 микрометров и определите положения, чтобы получить сшитое изображение всего органоида, чтобы получить участок органоидов, показывающий один слой клеток.
Добавьте один микролитр раствора n-ацетилцистеина в отрицательные контрольные скважины 96-луночной круглой донной пластины, содержащей органоиды. После часовой инкубации добавляют один микролитр раствора трет-бутилгидропероксида в соответствующие лунки и инкубируют в течение 30 минут. Затем, используя многоканальную пипетку, удалите среду, не нарушая прикрепленный BMM, и перенесите ее на другую 96-луночную круглую нижнюю пластину.
Держите эту тарелку в стороне. Затем добавьте 100 микролитров трипсина и, используя многоканальную пипетку, пипетку вверх и вниз пять раз, чтобы уничтожить BMM. После короткой пятиминутной инкубации диссоциируют органоиды, пипетируя вверх и вниз во второй раз.
Раскрутите пластину и выбросьте супернатант, перевернув пластину. Добавьте среду, ранее собранную в другой 96-луночной пластине, обратно в соответствующие скважины и повторно суспендируйте ячейки, пипетируя вверх и вниз пять раз. Затем добавьте один микролитр фторогенного зонда и инкубируйте в течение 30 минут.
Затем снова раскрутите пластину и повторно суспендируйте ячейки 250 микролитрами раствора DAPI. Перенесите образцы в проточные цитометрические трубки и держите трубки на льду. Оптимизируйте настройки напряжения прямого и бокового рассеяния на неиспорченных контрольных и лазерных напряжениях для каждого флуорофора с помощью моноисокнистых образцов.
Затем, используя соответствующую стратегию захвата, соберите минимум 20 000 событий. Репрезентативные конфокальные изображения окрашивания АФК и органоидов показали, что в присутствии ингибитора NAC виден только сигнал от мертвых клеток, содержащихся в просвете органоида. В необработанном органоиде можно увидеть базальные уровни АФК, особенно в клетках, положительных на GFP, доказывая, что стволовые клетки производят более высокий АФК, чем дифференцированные клетки.
GFP-положительные клетки представляют более значительный цитоплазматический сигнал с индуктором в присутствии фторогенного зонда, демонстрируя, что уровни АФК особенно увеличиваются в стволовых клетках после лечения. Анализ проточной цитометрии продукции АФК в органоидах кишечника показывает, что базальные уровни АФК снижаются после стимуляции ингибитором и увеличиваются после вызова индуктором. Клетки, предварительно обработанные ингибитором, а затем стимулируемые индуктором, имеют более низкие уровни, чем те, которые стимулируются только индуктором.
Аналогичный анализ стволовых клеток, закрытых как GFP положительный, показывает снижение уровня АФК в 3,5 раза при лечении ингибиторами и четырехкратное увеличение при лечении индуктором по сравнению с нестимстилированными клетками. При попытке этой процедуры пользователи должны помнить об ограничении клеточного стресса во время органоидных манипуляций и диссоциации. Кроме того, положительный и отрицательный контроль всегда должны включаться при анализе АФК.
После этой процедуры анализ может быть дополнен иммунофлуоресцентным окрашиванием на фиксированных интактных органоидах, сортировкой клеток и анализом экспрессии генов, чтобы получить дополнительную информацию о регуляции АФК. После просмотра этого видео вы должны знать, как выращивать мышиные кишечные органоиды, выполнять анализ неповрежденных органоидов в реальном времени и обрабатывать органы кишечника для анализа проточной цитометрии.
