هذه الطريقة هي أداة قيمة في مجال البيولوجيا الخلوية لتقييم مستويات ROS الخلوية في الخلايا الأولية الحية المزروعة في المختبر كعضويات باستخدام مسبار فلوروجيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور ROS نوعيا في المواد العضوية المعوية السليمة عن طريق الفحص المجهري وتحليلها كميا في الخلايا المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحات 96-well. يمكن تطبيق هذه الطريقة على النماذج العضوية الأخرى ويمكن استخدام أجهزة استشعار الفلورسنت البديلة لتحليل المسارات الخلوية المختلفة.
قبل تطبيق هذا البروتوكول لأول مرة ، يجب أن يصبح المجرب على دراية بالثقافة العضوية والمرور. على الرغم من أن بروتوكولنا يتكيف بشكل جيد مع أساليب الفحص ، إلا أنه يجب على المبتدئين البدء ببعض العينات. ستوضح الإجراء صوفي دولاوروي ، وهي مهندسة من المختبر.
بعد التضحية بفأر Lgr5-GFP عمره 8 إلى 10 أسابيع ، اجمع خمسة إلى ثمانية سنتيمترات من الصائم الذي يشمل المنطقة الواقعة بين الاثني عشر والدقاق ، وضعه في DPBS بارد مكمل بالمضادات الحيوية على الجليد. بعد ذلك ، قم بتنظيف المحتوى المعوي عن طريق التنظيف باستخدام خمسة إلى 10 ملليلتر من DPBS البارد الذي يحتوي على مضادات حيوية. ثم باستخدام مقص طرف الكرة ، افتح الأمعاء طوليا ، وباستخدام الملقط ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على DPBS البارد مع المضادات الحيوية.
رج الأنسجة داخل الطبق لشطفه. بعد ذلك ، أمسك بالأمعاء عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور البلاستيكية وانقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من 10 ملليمولار بارد EDTA. اقلب الأنبوب ثلاث مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة ، انقل الأنسجة في أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من DPBS والدوامة لمدة دقيقتين. أضف على الفور 10 ميكرولترات من الكسر في طبق بتري واستخدم المجهر لتقييم جودة الكسر. بعد عمليتي نقل في DPBS تحتوي على أنابيب مع دوامة لمدة دقيقتين بين كل عملية نقل ، احتضن الأمعاء في EDTA على الجليد لمدة خمس دقائق كما هو موضح سابقا.
بعد ثلاث عمليات نقل متتالية في أنابيب تحتوي على DPBS مع دوامة لمدة ثلاث دقائق بين كل عملية نقل ، قم بدمج أفضل الكسور في أنبوب 50 ملليلتر عن طريق عكس الأنابيب المحددة ثلاث مرات والتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون. ثم قم بتدوير الخبايا ، وتخلص من supernatant وقم بتعطيل الكريات ميكانيكيا قبل إضافة خمسة ملليلترات من DMEM F12 البارد. احسب عدد الخبايا الموجودة في 10 ميكرولتر أليكوت يدويا تحت المجهر.
بعد العد ، قم بتدوير الخبايا مرة أخرى وقم بإزالة supernatant بعناية. ثم قم بتعطيل الكريات ميكانيكيا وإضافة وسط ثقافة النمو إلى الأنبوب للحصول على تركيز 90 سكرابا لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف مجلدين من مصفوفة الغشاء السفلي غير المخفف أو BMM للحصول على تركيز نهائي من 30 سكرابا لكل ميكرولتر وماصة التعليق بعناية لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات الهواء في المزيج.
لتحليل قياس التدفق الخلوي ، تخلط لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا BMM كقبة في وسط كل بئر من لوحة مستديرة سفلية 96 بئرا تم تسخينها مسبقا. وللتصوير ، قم بإيداع 10 ميكرولترات من المزيج كطبقة رقيقة في غرفة ميكروسلايد ذات ثمانية آبار تم تسخينها مسبقا. بعد السماح ل BMM بالتصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ضع الألواح في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
بعد 15 دقيقة ، أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر ، مع الحرص على عدم فصل BMM ، ووضع اللوحة في الحاضنة. لتصور الإجهاد التأكسدي بواسطة المجهر البؤري ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون n-acetylcysteine في الآبار المقابلة لغرفة الشريحة الدقيقة المكونة من ثمانية آبار المطلية بالمواد العضوية. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون هيدروبيروكسيد تيرت بوتيل في الآبار المقابلة واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى.
بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من تخفيف 1.25 ملليموليار للمسبار الفلوروجيني لكل بئر ، متبوعا بميكرولتر واحد من 1.25 ملليغرام لكل ملليلتر محلول Hoechst. بعد حضانة أخرى لمدة 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM وأضف بلطف 250 ميكرولتر من DMEM الدافئ دون أحمر الفينول. قم بتصوير المواد العضوية باستخدام مجهر بؤري مجهز بغرفة حرارية وإمدادات غاز تكتشف المسبار الفلوروجيني.
باستخدام عنصر التحكم الإيجابي ، قم بإعداد شدة الليزر والتعرض للوقت لإشارة ROS ، وتحقق من أن هذه الإشارة أقل في عنصر التحكم السلبي. بعد ذلك ، باستخدام عدسة ، قم بفحص الشريحة لتحديد المواد العضوية التي تعبر عن GFP وضبط كثافة الليزر. قم بإعداد مكدس z من 25 ميكرومتر وتحديد المواضع للحصول على صورة مخيطة للعضوي بأكمله للحصول على قسم من المواد العضوية يظهر طبقة واحدة من الخلايا.
أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون n-acetylcysteine في آبار التحكم السلبية في الصفيحة السفلية المستديرة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على المواد العضوية. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة ، أضف محلول مخزون هيدروبيروكسيد ثلاثي بوتيل ميكرولتر واحد في الآبار المقابلة واحتضنه لمدة 30 دقيقة. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM المرفق ونقله إلى لوحة سفلية مستديرة أخرى ذات 96 بئرا.
احتفظ بهذه اللوحة جانبا. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من التربسين وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، ماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات لتدمير BMM. بعد حضانة قصيرة مدتها خمس دقائق ، قم بفصل المواد العضوية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مرة ثانية.
قم بتدوير اللوحة وتخلص من السوبرناتانت عن طريق عكس اللوحة. أضف الوسط الذي تم جمعه سابقا في صفيحة أخرى من 96 بئرا مرة أخرى إلى الآبار المقابلة وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من المسبار الفلوروجيني واحتضنه لمدة 30 دقيقة.
ثم قم بتدوير اللوحة مرة أخرى وإعادة تعليق الخلايا باستخدام 250 ميكرولتر من محلول DAPI. انقل العينات في أنابيب قياس التدفق الخلوي واحتفظ بالأنابيب على الجليد. قم بتحسين إعدادات جهد التشتت الأمامي والجانبي على التحكم غير الملطخ والجهد الكهربي بالليزر لكل فلوروفور باستخدام عينات أحادية اللون.
ثم باستخدام استراتيجية بوابة مناسبة ، قم بجمع ما لا يقل عن 20،000 حدث. أظهرت الصور التمثيلية متحدة البؤرة لتلطيخ ROS والمواد العضوية أنه في وجود مثبط NAC ، لا تظهر سوى الإشارة من الخلايا الميتة الموجودة في تجويف العضوي. في المواد العضوية غير المعالجة ، يمكن رؤية مستويات ROS القاعدية ، خاصة في الخلايا الإيجابية GFP ، مما يثبت أن الخلايا الجذعية تنتج ROS أعلى من الخلايا المتباينة.
تقدم الخلايا الإيجابية GFP إشارة سيتوبلازمية أكثر أهمية مع المحفز في وجود المسبار الفلوروجيني ، مما يدل على أن مستويات ROS تزداد بشكل خاص في الخلايا الجذعية بعد العلاج. يظهر تحليل التدفق الخلوي لإنتاج ROS في المواد العضوية المعوية أن مستويات ROS القاعدية تنخفض بعد التحفيز باستخدام مثبط وتزداد بعد التحدي باستخدام المستحث. الخلايا المعالجة مسبقا مع مثبط ثم تحفيزها مع المحفز الحاضر مستويات أقل من تلك التي تم تحفيزها مع المحفز وحده.
يظهر تحليل مماثل على الخلايا الجذعية المسورة كإيجابية GFP انخفاضا بمقدار 3.5 أضعاف في مستوى ROS عند العلاج المثبط وزيادة أربعة أضعاف عند العلاج المحث على الخلايا غير المحفزة. عند محاولة هذا الإجراء ، يجب على المستخدمين تذكر الحد من إجهاد الخلايا أثناء التلاعب العضوي والتفكك. بالإضافة إلى ذلك ، يجب دائما تضمين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية عند تحليل ROS.
بعد هذا الإجراء ، يمكن استكمال التحليل عن طريق تلطيخ التألق المناعي على المواد العضوية الثابتة السليمة ، وفرز الخلايا ، وتحليل التعبير الجيني للحصول على رؤى إضافية حول تنظيم ROS. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تعرف كيفية زراعة المواد العضوية المعوية الفئرانية ، وإجراء تحليل التصوير المباشر للعضويات السليمة ، ومعالجة الأعضاء المعوية لتحليل التدفق الخلوي.
