Este método es una herramienta valiosa en el campo de la biología celular para evaluar los niveles de ROS celulares en células primarias vivas cultivadas in vitro como organoides utilizando una sonda fluorogénica. La principal ventaja de esta técnica es que las ROS pueden visualizarse cualitativamente en organoides intestinales intactos mediante microscopía y analizarse cuantitativamente en células disociadas mediante citometría de flujo utilizando placas de 96 pocillos. Este método se puede aplicar a otros modelos organoides y se pueden usar sensores fluorescentes alternativos para analizar diferentes vías celulares.
Antes de aplicar este protocolo por primera vez, el experimentador debe familiarizarse con el cultivo de organoides y el pasaje. Aunque nuestro protocolo está bien adaptado a los enfoques de detección, los principiantes deben comenzar con algunas muestras. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sophie Dulauroy, ingeniera del laboratorio.
Después de sacrificar un ratón Lgr5-GFP de 8 a 10 semanas de edad, recolecte de cinco a ocho centímetros de la región que abarca el yeyuno entre el duodeno y el íleon, y colóquelo en DPBS frío suplementado con antibióticos en hielo. A continuación, limpie el contenido intestinal enjuagando con cinco a 10 mililitros de DPBS frío que contenga antibióticos. Luego, usando tijeras de punta de bola, abra el intestino longitudinalmente y, con fórceps, transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga DPBS frío con antibióticos.
Agite el pañuelo dentro del plato para enjuagarlo. A continuación, agarre el intestino por aspiración con una pipeta Pasteur de plástico y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de EDTA frío de 10 milimolares. Invierta el tubo tres veces e incube en hielo durante 10 minutos.
Después de la incubación, transfiera el tejido en un tubo que contenga 10 mililitros de DPBS y vórtice durante dos minutos. Agregue inmediatamente 10 microlitros de la fracción en una placa de Petri y use un microscopio para evaluar la calidad de la fracción. Después de dos transferencias en DPBS que contienen tubos con vórtice de dos minutos entre cada transferencia, incube el intestino en EDTA en hielo durante cinco minutos como se demostró anteriormente.
Después de tres transferencias sucesivas en tubos que contienen DPBS con vórtice de tres minutos entre cada transferencia, combine las mejores fracciones en un tubo de 50 mililitros invirtiendo los tubos seleccionados tres veces y filtrando a través de un colador de células de 70 micras. Luego gire las criptas, deseche el sobrenadante e interrumpa el pellet mecánicamente antes de agregar cinco mililitros de DMEM F12 frío. Cuente el número de criptas presentes en una alícuota de 10 microlitros manualmente bajo un microscopio.
Después de contar, gire las criptas nuevamente y retire cuidadosamente el sobrenadante. Luego, interrumpa mecánicamente el pellet y agregue un medio de cultivo de crecimiento al tubo para obtener una concentración de 90 criptas por microlitro. A continuación, agregue dos volúmenes de matriz de membrana basal sin diluir o BMM para obtener una concentración final de 30 criptas por microlitro y pipetee cuidadosamente la suspensión hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.
Para el análisis de citometría de flujo, los microlitros de placa 10 de las criptas BMM se mezclan como una cúpula en el centro de cada pozo de una placa de fondo redondo precalentado de 96 pocillos. Y para la obtención de imágenes, deposite 10 microlitros de la mezcla como una capa delgada en una cámara de ocho pocillos de microslídidos precalentados. Después de permitir que el BMM se solidifique a temperatura ambiente durante cinco minutos, coloque las placas en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Después de 15 minutos, agregue 250 microlitros de medio de crecimiento en cada pozo, teniendo cuidado de no separar el BMM, y coloque la placa en la incubadora. Para visualizar el estrés oxidativo por microscopía confocal, agregue un microlitro de solución madre de n-acetilcisteína en los pocillos correspondientes de la cámara de ocho pocillos del microslídeo chapado con organoides. Después de una incubación de una hora, agregue un microlitro de solución madre de hidroperóxido de terc-butilo en los pozos correspondientes e incube durante otros 30 minutos.
A continuación, agregue un microlitro de la dilución de 1,25 milimolares de la sonda fluorogénica por pozo, seguido de un microlitro de 1,25 miligramos por mililitro de solución de Hoechst. Después de otra incubación de 30 minutos, retire el medio sin molestar el BMM y agregue suavemente 250 microlitros de DMEM caliente sin rojo fenol. Tome una imagen de los organoides utilizando un microscopio confocal equipado con una cámara térmica y suministro de gas que detecta la sonda fluorogénica.
Usando el control positivo, configure la intensidad del láser y la exposición de tiempo para la señal ROS, y verifique que esta señal sea menor en el control negativo. A continuación, utilizando un ocular, revise la diapositiva para identificar los organoides que expresan GFP y ajustar la intensidad del láser. Configure una pila Z de 25 micrómetros y defina posiciones para obtener una imagen cosida de todo el organoide para obtener una sección de los organoides que muestre una capa de células.
Agregue un microlitro de la solución madre de n-acetilcisteína en los pozos de control negativos de la placa inferior redonda de 96 pocillos que contiene los organoides. Después de una incubación de una hora, agregue una solución madre de hidroperóxido de terc-butilo de microlitros en los pozos correspondientes e incube durante 30 minutos. Luego, con una pipeta multicanal, retire el medio sin molestar el BMM conectado y transfiéralo a otra placa inferior redonda de 96 pocillos.
Mantenga este plato a un lado. A continuación, agregue 100 microlitros de tripsina y use una pipeta multicanal, pipeta hacia arriba y hacia abajo cinco veces para destruir el BMM. Después de una breve incubación de cinco minutos, disocie los organoides mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo por segunda vez.
Gire la placa y deseche el sobrenadante invirtiendo la placa. Agregue el medio previamente recolectado en otra placa de 96 pocillos a los pozos correspondientes y vuelva a suspender las celdas canalizando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. A continuación, agregue un microlitro de la sonda fluorogénica e incube durante 30 minutos.
Luego gire la placa nuevamente y vuelva a suspender las células con 250 microlitros de solución DAPI. Transfiera las muestras en tubos de citometría de flujo y mantenga los tubos en hielo. Optimice la configuración de voltaje de dispersión hacia adelante y lateral en el control no manchado y los voltajes láser para cada fluoróforo utilizando muestras monoteñidas.
Luego, utilizando una estrategia de cierre adecuada, recopile un mínimo de 20, 000 eventos. Las imágenes confocales representativas de la tinción de ROS y los organoides mostraron que en presencia del inhibidor de NAC, solo es visible la señal de las células muertas contenidas en la luz del organoide. En el organoide no tratado, se pueden ver los niveles basales de ROS, particularmente en células GFP positivas, lo que demuestra que las células madre producen ROS más altas que las células diferenciadas.
Las células GFP positivas presentan una señal citoplasmática más significativa con el inductor en presencia de la sonda fluorogénica, lo que demuestra que los niveles de ROS aumentan particularmente en las células madre después del tratamiento. El análisis de citometría de flujo de la producción de ROS en los organoides intestinales muestra que los niveles basales de ROS disminuyen después de la estimulación con el inhibidor y aumentan después del desafío con el inductor. Las células pretratadas con inhibidor y luego estimuladas con inductor presentan niveles más bajos que las estimuladas con inductor solo.
Un análisis similar en células madre cerradas como GFP positivas muestra una disminución de 3,5 veces en el nivel de ROS en el tratamiento con inhibidores y un aumento de cuatro veces en el tratamiento con inductores sobre las células no estimuladas. Al intentar este procedimiento, los usuarios deben recordar limitar el estrés celular durante la manipulación y disociación de organoides. Además, siempre se deben incluir controles positivos y negativos al analizar ros.
Después de este procedimiento, el análisis se puede complementar con tinción de inmunofluorescencia en organoides intactos fijos, clasificación celular y análisis de expresión génica para obtener información adicional sobre la regulación de ROS. Después de ver este video, debe saber cómo cultivar organoides intestinales murinos, realizar análisis de imágenes en vivo de organoides intactos y procesar órganos intestinales para el análisis de citometría de flujo.
