Este método é uma ferramenta valiosa no campo da biologia celular para avaliar os níveis de ROS celulares em células primárias vivas cultivadas in vitro como organoides usando uma sonda fluorogênica. A principal vantagem dessa técnica é que o ROS pode ser qualitativamente visualizado em organoides intestinais intactos por microscopia e analisado quantitativamente em células dissociadas por citometria de fluxo usando placas de 96 poços. Este método pode ser aplicado a outros modelos organoides e sensores fluorescentes alternativos podem ser usados para analisar diferentes vias celulares.
Antes de aplicar este protocolo pela primeira vez, o experimentador deve se familiarizar com a cultura organoide e a passagem. Embora nosso protocolo esteja bem adaptado às abordagens de triagem, os iniciantes devem começar com algumas amostras. Demonstrando o procedimento estará Sophie Dulauroy, engenheira do laboratório.
Depois de sacrificar um rato Lgr5-GFP de 8 a 10 semanas de idade, colete de cinco a oito centímetros da região de jejunum entre o duodeno e o íleo, e coloque-o em DPBS frio suplementado com antibióticos no gelo. Em seguida, limpe o conteúdo intestinal lavando com cinco a 10 mililitros de DPBS frios contendo antibióticos. Em seguida, usando uma tesoura de ponta de bola, abra o intestino longitudinalmente, e usando fórceps, transfira o tecido para uma placa de Petri contendo DPBS frios com antibióticos.
Agite o tecido dentro do prato para enxaguar. Em seguida, pegue o intestino por aspiração usando uma pipeta pasteur de plástico e transfira-o para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de EDTA fria de 10 mililitros. Inverta o tubo três vezes e incuba-o no gelo por 10 minutos.
Após a incubação, transfira o tecido em um tubo contendo 10 mililitros de DPBS e vórtice por dois minutos. Adicione imediatamente 10 microlitros da fração em uma placa de Petri e use um microscópio para avaliar a qualidade da fração. Após duas transferências em DPBS contendo tubos com vórtice de dois minutos entre cada transferência, incubar o intestino em EDTA no gelo por cinco minutos, como demonstrado anteriormente.
Após três transferências sucessivas em tubos contendo DPBS com vórtice de três minutos entre cada transferência, combine as melhores frações em um tubo de 50 mililitros invertendo os tubos selecionados três vezes e filtrando através de um coador de células de 70 mícrons. Em seguida, gire as criptas, descarte o supernasce e interrompa a pelota mecanicamente antes de adicionar cinco mililitros de DMEM F12 frio. Conte o número de criptas presentes em uma alíquota de 10 microliter manualmente sob um microscópio.
Após a contagem, gire as criptas novamente e remova cuidadosamente o supernatante. Em seguida, interrompa mecanicamente a pelota e adicione cultura de crescimento ao tubo para obter uma concentração de 90 criptas por microliter. Em seguida, adicione dois volumes de matriz de membrana de porão não diluída ou BMM para obter uma concentração final de 30 criptas por microliter e pipetar cuidadosamente a suspensão para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.
Para análise da citometria de fluxo, a placa 10 microliters das criptas BMM mistura como uma cúpula no centro de cada poço de uma placa de fundo de 96 poços pré-aquecida. E para a imagem, deposite 10 microliters da mistura como uma camada fina em uma câmara de oito poços de microslide pré-aquecida. Depois de permitir que o BMM se solidifique à temperatura ambiente por cinco minutos, coloque as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após 15 minutos, adicione 250 microliters de meio de crescimento em cada poço, tomando cuidado para não desprender o BMM, e coloque a placa na incubadora. Para visualizar o estresse oxidativo por microscopia confocal, adicione um microliter de solução de estoque de n-acetilcisteína nos poços correspondentes da câmara de oito poços de microslídeo banhada com organoides. Após uma incubação de uma hora, adicione um microliter de solução de estoque de hidroperóxido de tert-butyl nos poços correspondentes e incubar por mais 30 minutos.
Em seguida, adicione um microliter da diluição de 1,25 milimilha da sonda fluorogênica por poço, seguido por um microliter de 1,25 miligramas por solução hoechst mililitro. Após outra incubação de 30 minutos, remova o meio sem perturbar o BMM e adicione suavemente 250 microliters de DMEM quente sem vermelho fenol. Imagem os organoides usando um microscópio confocal equipado com uma câmara e fornecimento de gás que detecta a sonda fluorogênica.
Usando o controle positivo, configure a intensidade do laser e a exposição de tempo para o sinal ROS, e verifique se este sinal é menor no controle negativo. Em seguida, usando uma ocular, trie o slide para identificar os organoides expressando GFP e ajustar a intensidade do laser. Configure uma pilha z de 25 micrômetros e defina posições para obter uma imagem costurada de todo o organoide para obter uma seção dos organoides mostrando uma camada de células.
Adicione um microliter da solução de estoque de n-acetilcisteína nos poços de controle negativos da placa inferior redonda de 96 poços contendo os organoides. Após uma incubação de uma hora, adicione uma solução de estoque de hidroperóxido de tert-butído de microliter nos poços correspondentes e incubar por 30 minutos. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, remova o meio sem perturbar o BMM anexado e transfira-o para outra placa inferior redonda de 96 poços.
Mantenha este prato de lado. Em seguida, adicione 100 microliters de trippsina e usando uma pipeta multicanal, pipeta para cima e para baixo cinco vezes para destruir o BMM. Depois de uma curta incubação de cinco minutos, dissociar os organoides pipetting para cima e para baixo uma segunda vez.
Gire a placa e descarte o supernaspente invertendo a placa. Adicione o meio coletado anteriormente em outra placa de 96 poços de volta aos poços correspondentes e resuspenque as células pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Em seguida, adicione um microliter da sonda fluorogênica e incubar por 30 minutos.
Em seguida, gire a placa novamente e resuspenque as células com 250 microliters de solução DAPI. Transfira as amostras em tubos de citometria de fluxo e mantenha os tubos no gelo. Otimize as configurações de tensão de dispersão dianteira e lateral em tensões de controle e laser não manchadas para cada fluoróforo usando amostras monotiadas.
Em seguida, usando uma estratégia de gating apropriada, coletar um mínimo de 20.000 eventos. Imagens confocal representativas de manchas de ROS e organoides mostraram que, na presença do inibidor do NAC, apenas o sinal das células mortas contidas no lúmen do organoide é visível. No organoide não tratado, os níveis basais de ROS podem ser vistos, particularmente nas células positivas do GFP, provando que as células-tronco produzem ROS maior do que as células diferenciadas.
As células positivas de GFP apresentam um sinal citoplasmado mais significativo com o indutor na presença da sonda fluorogênica, demonstrando que os níveis de ROS aumentam particularmente em células-tronco após o tratamento. A análise da citometria de fluxo da produção de ROS nos organoides intestinais mostra que os níveis de ROS basais diminuem após a estimulação com o inibidor e aumentam após desafio com indutor. As células pré-tratadas com inibidor e estimuladas com indutor apresentam níveis mais baixos do que aquelas estimuladas apenas com indutor.
Uma análise semelhante em células-tronco fechadas como GFP positivo mostra uma redução de 3,5 vezes no nível ros após o tratamento inibidor e um aumento de quatro vezes após o tratamento de indutores sobre células não estimuladas. Ao tentar esse procedimento, os usuários devem lembrar-se de limitar o estresse celular durante a manipulação e dissociação organoides. Além disso, controles positivos e negativos devem ser sempre incluídos ao analisar ros.
Após este procedimento, a análise pode ser complementada pela coloração da imunofluorescência em organoides intactos fixos, classificação celular e análise de expressão genética para obter insights adicionais sobre a regulação ros. Depois de assistir a este vídeo, você deve saber como cultivar organoides intestinais murinas, realizar análises de imagem ao vivo de organoides intactos e processar órgãos intestinais para análise de citometria de fluxo.
