이 방법은 형광성 프로브를 사용하여 유기체로 시험관에서 재배된 살아있는 1차 세포에서 세포 ROS 수준을 평가하기 위한 세포 생물학 분야에서 귀중한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 ROS가 현미경 검사법에 의해 온전한 장 오르가노이드로 질적으로 시각화되고 96웰 플레이트를 사용하여 혈류 세포측정에 의해 해리된 세포에서 정량적으로 분석될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 오르가노이드 모델에 적용될 수 있으며 대체 형광 센서를 사용하여 다른 세포 경로를 분석할 수 있습니다.
이 프로토콜을 처음으로 적용하기 전에 실험자는 오르가노이드 문화와 패시징에 익숙해져야합니다. 우리의 프로토콜은 선별 접근에 잘 적응되어 있지만 초보자는 몇 가지 샘플로 시작해야합니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 엔지니어인 소피 둘라우로이(Sophie Dulauroy)가 될 것입니다.
8-10주 된 Lgr5-GFP 마우스를 희생한 후 십이지장과 일루 사이에 있는 제주의 5~8cm를 모아 얼음에 항생제로 보충된 차가운 DPBS에 배치한다. 다음으로, 항생제를 함유한 감기 DPBS의 5~10밀리리터로 세척하여 장 내 함량을 청소한다. 그런 다음 볼 팁 가위를 사용하여 장내를 세로로 열고 집게를 사용하여 항생제로 차가운 DPBS를 함유 한 페트리 접시로 조직을 옮깁니다.
접시 안에 있는 조직을 흔들어 헹구세요. 다음으로, 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 원자를 포부로 잡고 차가운 10 밀리리터EDTA의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 튜브를 세 번 반전하고 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
인큐베이션 후, DPBS와 소용돌이의 10 밀리리터를 포함하는 튜브에서 조직을 2 분 동안 전송합니다. 페트리 접시에 분획 10 마이크로리터를 즉시 추가하고 현미경을 사용하여 분수의 품질을 평가합니다. DPBS에서 각 전송 사이에 2분 동안 소용돌이를 가하는 튜브가 포함된 두 번의 전송 후, 이전에 설명한 대로 5분 동안 EDTA의 내장을 얼음 위에 배양합니다.
DPBS를 함유한 튜브에서 3회 연속 이송한 후, 선택한 튜브를 세 번 반전하고 70미크론 세포 여과기를 통해 필터링하여 최적의 분획을 50 밀리리터 튜브에 결합합니다. 그런 다음 지하실을 회전시키고, 상체를 버리고, 차가운 DMEM F12의 5 밀리리터를 추가하기 전에 기계적으로 펠릿을 방해합니다. 현미경의 밑에 수동으로 10 마이크로 리터 알리쿼트에 존재하는 토굴의 수를 계산합니다.
계산 후, 다시 토굴을 회전하고 신중하게 상체를 제거합니다. 그런 다음 기계적으로 펠릿을 방해하고 마이크로 리터 당 90 개의 지하실의 농도를 얻기 위해 튜브에 성장 배양 매체를 추가합니다. 다음으로, 희석되지 않은 지하 멤브레인 매트릭스 또는 BMM의 두 볼륨을 추가하여 마이크로리터당 30개의 토굴의 최종 농도를 얻고 거품을 혼합에 도입하지 않고 서스펜션을 위아래로 조심스럽게 피펫합니다.
유동 세포측정 분석을 위해, 소굴의 10 마이크로리터 BMM 믹스는 미리 따뜻워진 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰의 중심에 돔으로 혼합됩니다. 그리고 이미징을 위해, 미리 따뜻워진 마이크로 슬라이드 8웰 챔버에서 얇은 층으로 믹스의 10 마이크로리터를 증착한다. BMM이 실온에서 5분 동안 고화할 수 있도록 허용한 후, 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 인큐베이터에 놓습니다.
15분 후, BMM을 분리하지 않도록 주의하여 각 우물에 250 마이크로리터의 성장 매체를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 공초점 현미경 검사법에 의해 산화 스트레스를 시각화하려면, 오가노이드로 도금 된 마이크로 슬라이드 8 웰 챔버의 해당 우물에 n-아세틸시스테인 스톡 솔루션의 마이크로 리터 를 추가합니다. 1시간 동안 인큐베이션을 한 후, 해당 우물에 테르트 부틸 하이드로퍼산화물 스톡 솔루션 1마이크로리터를 추가하고 30분 동안 배양합니다.
다음으로, 1.25 밀리머 희석제의 마이크로리터를 잘 합산한 다음 밀리리터 Hoechst 용액당 1.25 밀리그램의 마이크로리터를 첨가합니다. 또 다른 30 분 인큐베이션 후, BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 부드럽게 페놀 레드없이 따뜻한 DMEM의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 불소 발생 프로브를 감지하는 저혈 챔버 및 가스 공급이 장착된 공초점 현미경을 사용하여 유기체를 이미지합니다.
양수 제어를 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도 및 시간 노출을 설정하고 이 신호가 음수 제어에서 더 낮은지 확인합니다. 다음으로, 접제를 사용하여 슬라이드를 스크린하여 GFP를 표현하는 오르가노이드를 식별하고 레이저 강도를 조정합니다. 25 마이크로미터의 z 스택을 설정하고 세포의 한 층을 보여주는 오르가노이드의 단면을 얻기 위해 전체 오르가노이드의 스티치 이미지를 얻기 위해 위치를 정의합니다.
오르가노이드를 함유한 96웰 라운드 하단 플레이트의 네거티브 컨트롤 웰에 n-아세틸시스테인 스톡 용액의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 1시간 동안 인큐베이션한 후 해당 우물에 마이크로리터 테르트 부틸 하이드로퍼산화물 스톡 솔루션 1개를 추가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 연결된 BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 다른 96웰 원형 하단 플레이트로 전송합니다.
이 접시를 따로 두십시오. 다음으로, 트립신의 100 마이크로 리터를 추가하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 피펫을 위아래로 다섯 번 사용하여 BMM을 파괴합니다. 짧은 5 분 잠복 후, 두 번째 시간 위아래로 파이프팅하여 오르가노이드를 분리합니다.
접시를 회전하고 접시를 반전하여 상체를 폐기합니다. 이전에 다른 96웰 플레이트에서 수집한 배지를 해당 우물에 다시 넣고 5번 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 불소 질 프로브의 마이크로리터 1개를 추가하고 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 플레이트를 다시 회전시키고 DAPI 용액의 250 마이크로리터로 세포를 다시 분리합니다. 흐름 세포측정관에서 샘플을 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 단염색한 샘플을 사용하여 각 불소에 대한 스테인드 컨트롤 및 레이저 전압에서 전방 및 측면 분산 전압 설정을 최적화합니다.
그런 다음 적절한 게이팅 전략을 사용하여 최소 20, 000 이벤트를 수집합니다. ROS 염색 및 오르가노이드의 대표적인 공초점 이미지는 NAC 억제제의 존재에서, 오르가노이드의 루멘에 포함 된 죽은 세포로부터의 신호만 볼 수 있음을 보여 주었다. 비처리 된 오르가노이드에서, 기저 ROS 수준은 특히 GFP 양성 세포에서 볼 수 있으며, 줄기 세포가 분화 된 세포보다 더 높은 ROS를 생성한다는 것을 증명합니다.
GFP 양성 세포는 형광 탐사선이 존재하여 유도체와 함께 보다 중요한 세포질 신호를 제시하며, 치료 후 줄기 세포에서 특히 ROS 수치가 증가한다는 것을 입증한다. 장 기관가노이드에서 ROS 생산의 유동 세포 분석은 저해기로 자극 후 기저 ROS 수치가 감소하고 유도제와 도전 후에 증가한다는 것을 보여줍니다. 억제제로 전처리된 다음 유도제로 자극한 세포는 유도제만으로는 자극받은 세포보다 낮은 수준을 제시합니다.
GFP 양성으로 게이트된 줄기 세포에 대한 유사한 분석은 억제제 치료 시 ROS 레벨의 3.5배 감소와 비자극세포에 대한 유도제 치료에 따른 4배 증가를 나타낸다. 이 절차를 시도할 때 사용자는 organoid 조작 및 해리 중에 세포 스트레스를 제한하는 것을 기억해야 합니다. 또한 ROS를 분석할 때 항상 양수 및 음수 컨트롤을 포함해야 합니다.
이 절차에 이어, 분석은 ROS 조절에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 고정 된 그대로 유기체, 세포 정렬 및 유전자 발현 분석에 대한 면역 형광 염색에 의해 보완 될 수있다. 이 비디오를 시청한 후에는 뮤린 장 오르가노이드를 재배하고, 그대로 유기체에 대한 실시간 이미징 분석을 수행하고, 유동 세포측정 분석을 위한 장 기관을 처리하는 방법을 알아야 합니다.
